姚家喜 秦玉潔 單永瑋 魏小義 牛世杰 胡驍軼 郭劍明

腎細(xì)胞癌約占人類惡性腫瘤的3%，轉(zhuǎn)移性腎癌（metastatic renal cell carcinoma，mRCC）的5年生存率低于10%［1］。以酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase in?hibitors，TKI）為代表的靶向藥物出現(xiàn)為mRCC患者的治療帶來新的選擇，但最終仍有部分患者因耐藥導(dǎo)致疾病進(jìn)展直至死亡［2］。因此，對(duì)于mRCC的新型治療方法的研究從未停止，其中有針對(duì)性的免疫治療效果顯著［3］。程序性死亡受體-1（programmed cell death protein-1，PD-1）廣泛表達(dá)于人體內(nèi)各種細(xì)胞中，主要在腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）中表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡受體配體1（programmed cell death protein-ligand 1，PD-L1）結(jié)合，起到調(diào)控T細(xì)胞活性、抑制T細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷作用［4］。因此，PD-1陽性淋巴細(xì)胞可能參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。但在腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)并未證實(shí)ccRCC組織中的PD-1表達(dá)與臨床預(yù)后相關(guān)［5］。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）是一群免疫細(xì)胞，可以抑制自身免疫反應(yīng)及抑制自身CTL的抗腫瘤效應(yīng)［6］。研究顯示，腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞數(shù)量與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤預(yù)后不良有關(guān)［7］。本研究旨在評(píng)估腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的PD-1陽性淋巴細(xì)胞及Treg細(xì)胞與行TKI治療的mRCC患者的臨床病理資料及預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療mRCC的預(yù)后判斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2007年6月至2017年6月269例復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院mRCC患者的臨床病理資料，其中男性195例、女性74例，年齡為14～87歲，中位年齡為57歲。術(shù)后病理或穿刺活檢均證實(shí)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移部位為肺臟、骨、肝臟、腦等，切除的原發(fā)病灶標(biāo)本用于本研究。對(duì)病例均重新進(jìn)行TNM分期評(píng)估，根據(jù)國際泌尿病理協(xié)會(huì)（ISUP）對(duì)Fuhrman分級(jí)重新定義［8-9］。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)與患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)mRCC患者組織中的PD-1和Treg表達(dá)。于EDTA緩沖液中使用高壓抗原修復(fù)方法處理組織切片10 min。FoxP3（檢測(cè)Treg細(xì)胞）和PD-1抗體均購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司，稀釋比例為1:100，一抗4℃孵育過夜，37℃溫箱孵育二抗，DAB顯色、蘇木精復(fù)染。

1.2.2 結(jié)果判斷 評(píng)估每例腫瘤浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞和PD-1陽性細(xì)胞的數(shù)量。PD-1陽性細(xì)胞主要為腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞，先觀察整張切片（×100倍），隨后隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×400倍），求其平均值作為該病例PD-1陽性細(xì)胞數(shù)。根據(jù)PD-1陽性細(xì)胞在腫瘤組織中分布的多少分為陽性、陰性表達(dá)組。Treg細(xì)胞以同樣方法進(jìn)行計(jì)數(shù)，分為高表達(dá)、低表達(dá)組。

1.2.3 隨訪 所有患者均有完整的隨訪資料，隨訪截至2017年6月?？偵妫╫verall survival，OS）期的計(jì)算從手術(shù)日期至隨訪截止日期，或死亡日期；無進(jìn)展生存（progression-free survival，PFS）期的計(jì)算從手術(shù)日期至隨訪截止日期，或疾病進(jìn)展日期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料不同組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料不同組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存率的組間比較采用Kaplan-Meier生存曲線法及Log-rank檢驗(yàn)。單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析進(jìn)行評(píng)估Treg和PD-1與生存的關(guān)系。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1和Treg與mRCC患者臨床病理特征的關(guān)系

PD-1主要在細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，Treg細(xì)胞主要在腫瘤間質(zhì)中散在分布（圖1）。269例mRCC患者組織中PD-1陽性表達(dá)為85例，Treg高表達(dá)為99例。PD-1陽性表達(dá)與患者Fuhrman分級(jí)相關(guān)（P=0.004），Treg高表達(dá)與患者性別（P=0.004）、Fuhrman分級(jí)（P=0.011）顯著相關(guān)（表1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)mRCC患者組織中PD-1和Treg表達(dá)（DAB染色×200）

2.2 PD-1和Treg與mRCC患者術(shù)后生存的關(guān)系

269例mRCC患者的Kaplan-Meier生存分析顯示，mRCC患者組織中PD-1和Treg浸潤(rùn)的數(shù)量與患者生存相關(guān)，PD-1陽性與Treg高表達(dá)患者的OS（P=0.017 9與P=0.005 4）及PFS（P=0.019 2與P=0.044 2）更低（圖2）。PD-1聯(lián)合Treg（PD-1/Treg）評(píng)估m(xù)RCC患者的預(yù)后顯示，PD-1陽性/Treg高表達(dá)的患者的中位OS及PFS分別為23.5、10.0個(gè)月，預(yù)后最差；PD-1陰性/Treg低表達(dá)患者的中位OS及PFS分別為51.0、21.0個(gè)月，預(yù)后最佳（圖3）。

2.3 mRCC患者與PD-1和Treg表達(dá)關(guān)系的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析

單因素分析顯示，Treg、PD-1、TNM分期、Fuhrman分級(jí)、肺轉(zhuǎn)移、IMDC與OS顯著相關(guān)；Treg、PD-1、TNM分期、性別、肺轉(zhuǎn)移、IMDC與PFS顯著相關(guān)。將上述單因素有意義變量納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，TNM分期、肺轉(zhuǎn)移、IMDC和PD-1/Treg是mRCC患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素；TNM分期、IMDC和PD-1/Treg是mRCC患者PFS的獨(dú)立預(yù)后因素。PD-1陽性/Treg高表達(dá)患者的OS相對(duì)危險(xiǎn)度上升2.474倍（P=0.001），PFS相對(duì)危險(xiǎn)度上升2.065倍（P=0.002），見表2。

表1 269例患者臨床病理特征與PD-1和Treg表達(dá)的關(guān)系

表1 269例患者臨床病理特征與PD-1和Treg表達(dá)的關(guān)系（續(xù)表1）

圖2 mRCC患者術(shù)后OS和PFS與PD-1和Treg表達(dá)的關(guān)系

圖3 mRCC患者術(shù)后OS和PFS與PD-1/Treg表達(dá)的關(guān)系

表2 多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析各指標(biāo)與mRCC患者OS及PFS之間的關(guān)系

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)性PD-1及Treg對(duì)mRCC預(yù)后有獨(dú)立預(yù)測(cè)作用。PD-1表達(dá)和Treg細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量是mRCC患者OS和PFS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，提示PD-1/Treg可作為mRCC患者的預(yù)后指標(biāo)。納武單抗（nivolumab）與依維莫司對(duì)比的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析顯示，在既往使用舒尼替尼的患者中，二線治療使用nivolumab與依維莫司的中位OS分別為23.6、19.8個(gè)月；既往使用帕唑帕尼的患者中，二線治療使用nivolumab與依維莫司的中位PFS分別為15.6、11.7個(gè)月［10-11］。因此，相比TKI靶向藥物，PD-1靶向免疫治療可能具有更好的應(yīng)用價(jià)值及療效，免疫治療在mRCC中顯示出巨大潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)，PD-1及Treg均與mRCC不良預(yù)后指標(biāo)（Fuhrman分級(jí)）顯著相關(guān)，生存分析顯示Treg高表達(dá)預(yù)示mRCC的OS和PFS較短。Whiteside等［12］研究表明，腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)性Treg高表達(dá)與各種惡性腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)，腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量高于健康人，治愈性切除腫瘤后，外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量降至正常水平。同時(shí)該研究表明，腫瘤相關(guān)因子可能參與Treg的浸潤(rùn)聚集，但Treg如何參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的確切機(jī)制尚未明確。Treg相關(guān)免疫抑制功能可能通過阻斷T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的功能來介導(dǎo)。Kim等［5］采用免疫組織化學(xué)法對(duì)ccRCC患者組織中的PD-1進(jìn)行檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)與臨床預(yù)后相關(guān)，可能與研究對(duì)象為非mRCC有關(guān)，且病例數(shù)相對(duì)較少。因此本研究針對(duì)mRCC組織中的PD-1及Treg表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其與OS及PFS的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Treg浸潤(rùn)與PD-1陽性細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著相關(guān)（P＜0.001），56.5%（48/85）PD-1陽性患者同時(shí)存在Treg高表達(dá)。本研究結(jié)果表明，PD-1與Treg介導(dǎo)的免疫抑制顯著相關(guān)，PD-1的阻斷和Treg的功能抑制可能是mRCC免疫治療的一種可選治療方法。因此，評(píng)估m(xù)RCC患者組織中PD-1和Treg有助于對(duì)預(yù)后不良進(jìn)行判斷，以利于盡早干預(yù)治療。mRCC的治療正發(fā)生日新月異的變化，隨著近幾年多種藥物通過FDA批準(zhǔn)快速上市，以及免疫治療興起，以nivolumab和派姆單抗（pembrolizumab）及伊匹單抗（ipilimumab）為代表的免疫治療藥物在惡性腫瘤患者中廣泛應(yīng)用。nivolumab已被批準(zhǔn)用于TKI治療失敗后的二線治療，以及聯(lián)合ipilimumab治療先前未行藥物治療的中高危的晚期RCC患者。正在開展的臨床試驗(yàn)可能會(huì)加快一線治療中nivolumab單藥的使用，或聯(lián)合TKI藥物治療的審批早日通過。

綜上所述，本研究表明mRCC腫瘤內(nèi)PD-1及Treg浸潤(rùn)為不良預(yù)后指標(biāo)，PD-1陽性/Treg高表達(dá)患者的OS及PFS較PD-1陰性/Treg低表達(dá)者差，對(duì)預(yù)測(cè)mRCC的預(yù)后具有良好價(jià)值。因此，評(píng)估m(xù)RCC患者腫瘤組織中PD-1表達(dá)和Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)有助于選擇合適患者進(jìn)行有效的免疫治療，盡早對(duì)臨床上預(yù)后不良的患者進(jìn)行早期干預(yù)治療。