海岳東，白 爽,王育民,圖門烏力吉,趙 盛,王睿君

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050)

膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重危害人體健康[1]。盡管在過(guò)去的幾十年中治療方法顯著的改善，但膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后和存活仍然較差[2]，因此，迫切需要找到有效措施來(lái)解決上述問(wèn)題。研究顯示膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)極大地限制了治療效果和預(yù)后[3]，因此，尋找抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的新治療方法對(duì)于改善預(yù)后至關(guān)重要[4]。蒙藥烏力地格又稱為梅花草，烏力地格氣味干枯，具有清熱解毒以及破痞的功效，在現(xiàn)代蒙醫(yī)臨床應(yīng)用中烏力地格是治療腫瘤的常用藥材之一。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)蒙藥烏力地格的破痞功效作用機(jī)制尚未闡明，本研究通過(guò)建立人膠質(zhì)瘤移植瘤模型，探討蒙藥烏力地格對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響并初步探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命細(xì)胞庫(kù)。將U251細(xì)胞系培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(美國(guó)，Invitrogen公司)，1%鏈霉素(美國(guó)，Sigma-Aldrich公司)和青霉素(美國(guó)，Sigma-Aldrich公司)的DMEM(美國(guó)，Invitrogen公司)中，在37℃下含有5%的二氧化碳的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞用0.25%胰酶(美國(guó)，Invitrogen公司)消化后，800 rpm離心5 min后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用PBS將膠質(zhì)瘤細(xì)胞稀釋為1×107個(gè)/ml，用于接種。

1.2烏力地格提取物制備取1 kg烏力地格，浸泡于95%的乙醇溶液中，置于圓底燒瓶中加熱浸煮，每次煮 3 h，提取 3 次，將3次所得的煮液合并為提取液，減壓濃縮干燥后得浸膏，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3移植瘤模型建立與分組24只SPF級(jí)6-8周齡雄性BALB/c裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，所以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)在無(wú)菌環(huán)境下。取100 μl稀釋好的膠質(zhì)瘤細(xì)胞1×106個(gè)接種于裸鼠左側(cè)肩胛區(qū)，將注射器針頭留在原位1 min后緩慢慢拔出針頭，然后監(jiān)測(cè)動(dòng)物的恢復(fù)情況。待腫瘤細(xì)胞接種后第7天，將裸鼠(n=24)隨機(jī)分為4組(n=6/組)：對(duì)照組(無(wú)菌生理鹽水)，低劑量治療組(蒙藥烏力地格 10 mg/kg)，中劑量治療組(蒙藥烏力地格20 mg/kg)和高劑量治療組(蒙藥烏力地格40 mg/kg)，灌胃給藥，每天給藥1次，每隔1天測(cè)量腫瘤變化，計(jì)算腫瘤體積，給藥14天后，脫臼處死裸鼠，并取出腫瘤稱重記錄。所有實(shí)驗(yàn)倫理和動(dòng)物研究均經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4ELISA方法將腫瘤組織用RIPA緩沖液裂解，用組織研磨器進(jìn)行勻漿處理，離心后取上清，使用ELISA凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，按產(chǎn)品說(shuō)明方法進(jìn)行操作，于405 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)不同組OD值。凋亡細(xì)胞率以富集系數(shù) EF 表示，EF值=(待測(cè)樣品 OD 值-本底 OD值)/陰性對(duì)照 OD 值×100%。

1.5qRT-PCR方法將腫瘤組織加入1 ml Trizol試劑(美國(guó)，Invitrogen公司)，用組織研磨器勻?qū)⑻幚聿⑻崛NA，通過(guò)SYBR Green PCR kit(美國(guó)，Takara公司)和ABI 7500 FAST Real-Time PCR system(美國(guó)，Thermo Fisher)檢測(cè)試劑盒，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書，檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR的mRNA表達(dá)。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5 s，60℃退火35 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。通過(guò)2-ΔΔCt方法相對(duì)定量評(píng)估RNA表達(dá)，GAPDH mRNA作為 mRNA的內(nèi)參。引物序列如下：PI3K正向引物5′-TGAGCACATACAACGACCAAT-3′，反向引物5′-ACCATCAGCTTCTTCCCATC-3′；AKT正向引物5′-AGCGCCTGTTCAGTGGTTTA-3′，反向引物5′-ATTGGTTCCGTTCTCCGTGT-3′，mTOR正向引物5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，反向引物5′-CCTCGGGGCATCGGAA-3′。

1.6Westernblotting方法用RIPA緩沖液(美國(guó)，Thermo Scientific公司)裂解神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織，從裂解緩沖液中提取蛋白質(zhì)樣品，并使用BCA試劑盒Pierce(美國(guó)，Thermo Scientific公司)檢測(cè)蛋白濃度。將等量的蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，聚二氟乙烯膜PVDF(美國(guó)，Millipore公司)用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移，然后將PVDF膜用含有5%脫脂奶粉的PBST在室溫下封閉1 h，封閉結(jié)束后，加入相應(yīng)一抗，4℃下孵育過(guò)夜。一抗：PI3K(1∶1000，美國(guó)，Abcam公司)、AKT(1∶1000，美國(guó)，Abcam公司)、mTOR(1∶1000，美國(guó)，Abcam公司)、LC3-Ⅰ(1∶1000;美國(guó)，Sigma-Aldrich)、LC3-Ⅱ(1∶1000，美國(guó)，Sigma-Aldrich)、Beclin-1(1∶500，美國(guó)，Santa Cruz公司)。第2天用PBST洗滌后，將PVDF膜與二抗(1∶5000，美國(guó)，Invitrogen)在室溫下孵育1 h。然后使用Super ECL Plus(美國(guó)，Thermo Scientific公司)捕獲目的條帶，并使用ChemiDocTM XRS+ system (美國(guó)，Bio-Rad)檢測(cè)。β-tubulin為內(nèi)參。

1.7統(tǒng)計(jì)分析本研究中的所有數(shù)據(jù)顯示為3次獨(dú)立重復(fù)結(jié)果的均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x—±SD)，并使用SPSS 18.0軟件和GraphPad Prism 6進(jìn)行分析。P<0.05表示統(tǒng)計(jì)上顯著性。

2 結(jié)果

2.1蒙藥烏力地格抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于裸鼠左側(cè)肩胛，待成瘤后，分別給予不同劑量的蒙藥烏力地格(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)，如圖1所示，蒙藥烏力地格抑制膠質(zhì)瘤移植瘤的生長(zhǎng)。與對(duì)照組比較，蒙藥烏力地格呈劑量依賴性的抑制膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。

圖1 蒙藥烏力地格抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)

2.2蒙藥烏力地格誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡為了確定蒙藥烏力地格對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的抑制作用是否與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)了蒙藥烏力地格對(duì)膠質(zhì)瘤組織的凋亡的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，蒙藥烏力地格不同程度的促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，隨著給藥劑量的增加，膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡顯著(P<0.05)(圖2)。

圖2 蒙藥烏力地格促進(jìn)膠質(zhì)瘤組織中細(xì)胞凋亡

2.3蒙藥烏力地格抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活為了確定蒙藥烏力地格對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，本研究利用qRT-PCR和WB檢測(cè)了不同實(shí)驗(yàn)組膠質(zhì)瘤組織中PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白表達(dá)水平，研究結(jié)果顯示，蒙藥烏力地格抑制PI3K、AKT、mTOR的mRNA和蛋白水平，呈劑量依賴性，結(jié)果提示蒙藥烏力地格抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤組織中細(xì)胞凋亡(圖3、圖4)。

圖3 蒙藥烏力地格對(duì)PI3K、AKT和mTOR的mRNA表達(dá)的影響

圖4 蒙藥烏力地格對(duì)PI3K、AKT和mTOR的蛋白表達(dá)的影響

2.4蒙藥烏力地格誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬為了研究自噬與凋亡的關(guān)系，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)情況。WB檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，蒙藥烏力地格上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LI3的Beclin-1表達(dá)，隨著蒙藥烏力地格劑量的增加而增加，且隨著藥物濃度增加，LI3-I向L3-II轉(zhuǎn)化增多(圖5)。

圖5 蒙藥烏力地格促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤作為最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)生率為5/100000。膠質(zhì)瘤顯示出侵襲性生長(zhǎng)，可在腫瘤周圍2厘米范圍內(nèi)的正常腦組織中生長(zhǎng)。由于惡性膠質(zhì)瘤具有很高的生長(zhǎng)能力，因此即使在手術(shù)切除整個(gè)腫瘤后，切口邊緣仍無(wú)法避免其復(fù)發(fā)[5]。此外，化學(xué)療法和放射療法不僅沒(méi)有特異性地殺死神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，導(dǎo)致治療效果差，而且還可能產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和嚴(yán)重的副作用。因此，即使聯(lián)合治療，預(yù)后和中位生存期仍遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期。鑒于上述情況在近30年的臨床實(shí)踐中尚未得到根本改善，膠質(zhì)瘤仍是神經(jīng)外科手術(shù)中的難治性疾病[6]。因此，尋找新的有效的治療藥物仍然至關(guān)重要。

蒙藥治療惡性腫瘤具有獨(dú)特的經(jīng)驗(yàn)和方法，臨床治療過(guò)程中用藥少，臨床療效顯著，且毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，蒙藥的抗腫瘤作用及其相關(guān)作用機(jī)制的研究已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)蒙藥烏力地格可以抑制肝癌、宮頸癌細(xì)胞的增殖[7,8]，然而關(guān)于其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響，國(guó)內(nèi)外尚為空白。本研究通過(guò)建立U251膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤模型，研究其對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，蒙藥烏力地格抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，隨著給藥劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)，呈劑量依賴性。細(xì)胞生長(zhǎng)受細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等調(diào)控，為了研究蒙藥烏力地格抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)制，進(jìn)一步分析了膠質(zhì)瘤組織中膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示隨著給藥劑量的增加，膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡顯著。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路廣泛存在于真核細(xì)胞中，該信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等多種途徑發(fā)揮作用[9]。研究表明PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過(guò)度激活，提示該信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[10]，本研究進(jìn)一步分析了蒙藥烏力地格對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示蒙藥烏力地格抑制PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白的表達(dá)，提示蒙藥烏力地格通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路從而誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞所特有的一種胞內(nèi)代謝途徑，細(xì)胞通過(guò)自我消化折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)或受損的細(xì)胞器，為機(jī)體提供物質(zhì)能量從而保證大分子的合成[11]。自噬與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究證明自噬能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。本研究觀察到蒙藥烏力地格促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬作用，而關(guān)于蒙藥烏力地格誘導(dǎo)的自噬作用是否與凋亡相關(guān)，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)蒙藥烏力地格抑制U251膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，其通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。