張淑娟,梁景耀,田 歆,劉玉梅

(廣州市皮膚病防治所 皮膚科, 廣東 廣州510095)

有汗性外胚葉發(fā)育不良綜合征(Hidrotic ectodermal dysplasia,HED)，又稱Clouston syndrome(OMIM no.129500)，是一種以甲營(yíng)養(yǎng)不良、毛發(fā)缺陷和掌趾角化(或牙齒發(fā)育不良)等三聯(lián)征為特征的遺傳性綜合征，屬常染色體顯性遺傳[1]。

既往研究認(rèn)為，HED的致病基因定位于13q11-q12.1，為編碼人縫隙連接蛋白Cx30(connexin30)的GJB6(gap junction protein beta 6)[2]。目前發(fā)現(xiàn)患者GJB6有四個(gè)突變位點(diǎn)與疾病明確相關(guān)，包括G11R,V37E,D50N和A88V[3]。

近期筆者收集了一個(gè)HED的家系，家系患病成員具有典型的三聯(lián)征表型，包括甲營(yíng)養(yǎng)不良、毛發(fā)缺陷和掌趾角化，但經(jīng)全外顯子測(cè)序及Sanger測(cè)序的方法并未發(fā)現(xiàn)GBJ6突變，而發(fā)現(xiàn)有GBJ2基因的突變異常。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

家系情況見圖1，家系中患兒(III1)為典型的HED患者，其母(II2)及舅舅(II3)表型嚴(yán)重程度不一，外顯不全。其父(II1)、爺爺(I2)、奶奶(I1)、外公(I4)、外婆(I3)為正常表型。

圖1 HED綜合癥患者家系圖(圖中箭頭所示為先證者)

患兒(III1)，3歲，患手掌足底紅斑角化3年。患兒出生時(shí)無頭發(fā)、眉毛生長(zhǎng)，全身毳毛稀疏。半歲時(shí)足底出現(xiàn)指甲蓋大小紅斑，逐漸擴(kuò)大，并在紅斑上出現(xiàn)角化，紅斑角化進(jìn)行性加重，漸累及雙手手指，伴皸裂疼痛。趾甲自1歲起出現(xiàn)甲營(yíng)養(yǎng)不良改變。體格檢查：生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，身高85 cm，體重12 kg。語言障礙。視力、聽力正常，牙齒排列整齊。系統(tǒng)檢查無異常。皮膚科檢查：全身皮膚毳毛稀少，頭發(fā)缺失，頭皮光滑，眉毛、睫毛均缺如。雙手手指可見境界清楚的紅斑角化，覆鱗屑，部分剝脫，伴皸裂。雙足前端見紅斑角化，覆厚層黃色角化性斑塊，伴皸裂，左足為甚。部分趾甲灰黃，上見凹痕。

其母(II2)自幼無頭發(fā)、眉毛生長(zhǎng)，伴趾甲灰黃、粗糙，凹凸不平，但掌趾角化不明顯。其舅(II3)自幼無頭發(fā)生長(zhǎng)，指甲正常，無掌趾角化。

1.2 方法

1.2.1全外顯子組測(cè)序

經(jīng)過知情同意后，取患兒(III1)外周血4 ml，EDTA抗凝，負(fù)80℃保存。采用DNA提取試劑盒抽提基因組。全外顯子組測(cè)序服務(wù)由華大基因提供。簡(jiǎn)要實(shí)驗(yàn)及分析流程：將基因組DNA打斷后制備文庫。外顯子捕獲下來，經(jīng)PCR線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫質(zhì)檢，合格即可進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)庫檢合格文庫的有效濃度及數(shù)據(jù)產(chǎn)出需求進(jìn)行Illumina HiSeq 4000 PE150測(cè)序。獲得原始測(cè)序序列后，去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)以及人群中高頻率的變異位點(diǎn)。

1.2.2Sanger測(cè)序驗(yàn)證

經(jīng)過知情同意后，取患兒(III1)、患兒母親(II2)、舅舅(II3)、外婆(I3)以及外公(I4)外周血4ml，EDTA抗凝，負(fù)80℃保存。采用DNA提取試劑盒抽提基因組。Sanger測(cè)序利用雙脫氧末端終止法的原理，測(cè)序服用由華大基因提供。測(cè)序位點(diǎn)為GBJ6的四個(gè)經(jīng)典突變位點(diǎn)，G11R(rs104894415)，V37E(rs104894416)，D50N(CM085977)，A88V(rs28937872)。以及檢測(cè)GBJ2的突變位點(diǎn)235delC(rs80338943)。

2 結(jié)果

2.1 患兒全外顯子組測(cè)序結(jié)果

對(duì)患兒進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)編碼縫隙連接蛋白Cx26的GBJ2基因發(fā)生突變[4]，突變位點(diǎn)為rs80338943，又名235delC。

HED經(jīng)典的致病基因GBJ6的四個(gè)位點(diǎn)G11R(rs104894415)，V37E(rs104894416)，D50N(CM085977)，A88V(rs28937872)均無突變。另外，既往報(bào)道的GJA1基因的V41L位點(diǎn)，以及GJB2的R127H、F191L位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)突變[5，6]。

2.2 家系Sanger測(cè)序結(jié)果

患兒(III1)、患兒母親(II2)、舅舅(II3)、外婆(I3)以及外公(I4)5個(gè)樣本經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，得出以下結(jié)果。

在5個(gè)樣本中，GBJ6的4個(gè)經(jīng)典突變位點(diǎn)，G11R(rs104894415)，V37E(rs104894416)，D50N(CM085977)，A88V(rs28937872)均未發(fā)生突變。

GBJ2在患兒(III1)、患兒母親(II2)、外婆(I3)中發(fā)生突變，突變位點(diǎn)均為rs80338943?；純和蛔冃蛄袨镚CTATGGGCC[-/C]TGCAGCTGAT?；純耗赣H突變序列為GCTATGGGCC[C/-]TGCAGCTGAT，外婆突變序列為GCTATGGGCC[C/-]TGCAGCTGAT。外公(I4)以及舅舅(II3)在該位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)突變(圖2)。

3 討論

外胚葉發(fā)育不良(ectodermal dysplasias,ED)是一組臨床表型多樣的遺傳性疾病，主要累及頭發(fā)、牙齒、指甲和皮膚[7]。其中HED是最為常見的類型，并以甲營(yíng)養(yǎng)不良、毛發(fā)缺陷和掌趾角化三聯(lián)征為特征。受遺傳和環(huán)境的影響，患者的表型可有異質(zhì)性，有時(shí)僅有其中1-2種臨床表現(xiàn)[8]。在本研究中，患兒具有典型的三聯(lián)征表型，可以明確診斷為HED。而母親只有普禿和指甲損害，掌趾角化不明顯；其舅只有普禿。該家系的3名患者符合HED表型多樣的特點(diǎn)。

縫隙連接蛋白(connexin,Cx)是構(gòu)成細(xì)胞間縫

圖2 Sanger測(cè)序結(jié)果。A-D為患兒(III1)GBJ6四個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果；E顯示患兒(III1)GBJ2的rs80338942位點(diǎn)發(fā)生突變

隙連接(gapjunction,GJ)通道的基本結(jié)構(gòu)和功能的一大類膜蛋白。它們參與細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)，并在維持皮膚平衡中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[9]。既往大部分研究中，編碼Cx30的GJB6被認(rèn)為是HED的重要致病基因之一，其四個(gè)位點(diǎn)的突變(G11R,V37E,D50N和A88V)與疾病明確相關(guān)[1-3]。而在本研究中，雖然患兒(III1)有典型的HED三聯(lián)癥的表型，但無論采取全外顯子測(cè)序還是Sanger測(cè)序，并未發(fā)現(xiàn)GJB6(位點(diǎn)G11R,V37E,D50N和A88V)的突變，其余兩例不完全表型的患者(II2，II3)亦無GJB6突變。該結(jié)果提示GJB6并不是HED必需的或者唯一的致病基因。

外顯子組的序列僅占全基因組序列的1%左右，但85%致病突變位于外顯子區(qū)。為了探索本HED家系中是否存在GJB6以外的致病突變，本課題組進(jìn)行了全外顯子測(cè)序，即利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量檢測(cè)[10]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GBJ2在患兒中發(fā)生突變。并進(jìn)一步用Sanger測(cè)序的方法確認(rèn)患兒(III1)、患兒母親(II2)、外婆(I3)均攜帶GBJ2突變，突變位點(diǎn)均為rs80338943(又名235delC)。GBJ2編碼Cx26，與GJB6類似，也是編碼縫隙連接蛋白。GJB2主要表達(dá)于皮膚和內(nèi)耳，其突變可引起皮膚異常及耳聾[9]。在過往的研究中，發(fā)現(xiàn)GJB2的R127H、F191L位點(diǎn)發(fā)生突變，與HED相關(guān)[5，6]。而GJB2基因235delC位點(diǎn)突變與HED的關(guān)系暫未見報(bào)道。然而，家系中舅舅(II3)未攜帶GJB2突變基因而有普禿表型，而外婆表型正常而攜帶GJB2基因突變，提示GJB2基因235delC位點(diǎn)的突變與HED的關(guān)系有待進(jìn)一步確認(rèn)。另外，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，GJA1基因(編碼Cx43)V41L位點(diǎn)的突變與HED的發(fā)病相關(guān)[6]，但在本研究的全外顯子測(cè)序結(jié)果中亦沒有發(fā)現(xiàn)GJA1的突變。

本課題報(bào)道了一個(gè)具有典型HED表型的家系，并通過全外顯子測(cè)序及Sanger測(cè)序，篩查HED家系的致病基因，發(fā)現(xiàn)HED患者并沒有攜帶既往報(bào)道的GJB6(G11R,V37E,D50N和A88V)、GJB2(R127H、F191L)以及GJA1(V41L)基因位點(diǎn)的突變。本研究為探明HED疾病的相關(guān)基因及分子機(jī)制提供新的線索和思路。