袁銀花，馮雙苗，張化蓮

(駐馬店市中心醫(yī)院 產(chǎn)二科，河南 駐馬店463000)

先兆子癇是一種以高血壓和蛋白尿為主要特征的妊娠期特異性疾病，其多發(fā)于妊娠20周后，是造成我國孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡主要原因之一[1]。發(fā)生于孕34周前的先兆子癇稱為早發(fā)型先兆子癇，其母嬰的并發(fā)癥發(fā)生率較高，應(yīng)引起廣泛重視[2]。目前，有關(guān)先兆子癇的發(fā)病機制尚未形成完整闡述，但普遍認為血管內(nèi)皮損傷和胎盤胎血是造成先兆子癇發(fā)生的根源，近年來對先兆子癇孕婦胎盤的組織學檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者胎盤滋養(yǎng)層存在異常侵襲、滋養(yǎng)層細胞存在凋亡現(xiàn)象[3]。坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(collapsin response mediator protein-1,CRMP-1)是一種磷酸化糖蛋白，研究表明其參與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移，滋養(yǎng)層細胞浸潤與腫瘤細胞侵襲行為較為相似，但目前鮮少有CRMP-1在先兆子癇胎盤組織中的相關(guān)報道[4]。因此，本研究旨在探討CRMP-1在不同類型先兆子癇孕婦胎盤組織中的表達水平，為后期該類疾病的臨床診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年1月-2017年6月在本院住院的先兆子癇孕婦60例作為研究對象，其中早發(fā)型先兆子癇孕婦30例(發(fā)病孕周<34周)，遲發(fā)型先兆子癇孕婦30例(發(fā)病孕周≥34周)，所有孕婦均符合樂杰主編《婦產(chǎn)科學》第7版的相關(guān)標準[5]，并經(jīng)院倫理委員會批準，排除糖尿病、原發(fā)高血壓、自身免疫系統(tǒng)疾病等。另選取不同階段終止妊娠或剖宮產(chǎn)的健康孕婦60例作為對照組，其中妊娠前期組20例(孕5-13周)因社會因素、胎位異常等自愿選擇手術(shù)終止妊娠；妊娠中期組11例(孕14-27周)因?qū)m頸無力、產(chǎn)道異常選擇終止妊娠；妊娠晚期29例(≥28周)行剖宮產(chǎn)。并通過妊娠孕周匹配從健康孕婦中分別選取早發(fā)型先兆子癇和遲發(fā)型先兆子癇的對照組。各組孕婦的年齡、產(chǎn)次、孕次比較，差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 各組孕婦一般資料比較

1.2 試劑與儀器

兔抗人CRMP-1抗體購自上海希美生物科技有限公司；SP-9710試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。石蠟切片機、包埋機、攤片機、烘片機均購自德國Leica公司；光學顯微鏡購自日本Olypus公司。

1.3 方法

1.3.1標本采集

在分娩室或手術(shù)室收集胎盤，在中央小葉取1.0 cm*1.0 cm*1.5 cm的組織塊，采用無菌生理鹽水沖洗后置入福爾馬林中固定，并將胎盤組織依次置于70%、90%、95%、100%濃度的乙醇中進行梯度脫水，置入二甲苯中兩次進行透明，將組織浸蠟，放入包埋框中進行包埋，并保存于-20℃冰箱中備用。

1.3.2免疫組化檢測

采用免疫組化法對胎盤組織CRMP-1進行檢測，具體步驟如下：①將蠟塊切成厚度為5 μm的切片，展片、烘烤固定；②將切片進行常規(guī)脫蠟，置入不同濃度乙醇中進行梯度脫蠟水化；③無菌磷酸鹽換沖液(PBS)沖洗切片3次，滴加3%過氧化氫室溫處理10 min以滅活內(nèi)源性酶；③PBS洗片，滴加山羊血清進行室溫封閉30 min；④棄掉封閉液，加入按照說明書比例稀釋的CRMP-1抗體，4℃孵育過夜；⑤PBS洗滌3次，滴加HRP標記的二抗室溫孵育10-15 min；⑥PBS洗片后，進行DAB顯色，蒸餾水終止顯色，采用蘇木素復燃核，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒后，流水沖洗返藍；⑦滴度酒精脫水后，采用二甲苯透明，滴加中性樹膠封片，在顯微鏡下進行觀察拍照。

1.3.3結(jié)果判定

參照文獻[6]，采用陽性細胞所占比例和染色強度雙評分半定量法對免疫組化陽性結(jié)果進行判定，染色強度評分：0分為無著色，1分為輕染色、淺黃色，2分為中染色、棕黃色，3分為強染色、棕褐色；陽性細胞所占比例評分：0分表示<25%，1分表示25%-50%，2分表示50%-75%，3分表示>75%。每個標本隨機取3個不同視野進行評分，最終取平均值，按照染色強度與陽性細胞百分比的和評定陽性程度：陰性(-)為≤1分；弱陽性(+)為12分；中等陽性(++)為3-4分 ；強陽性(+++)為5-6分。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較采用檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 正常妊娠組婦女不同妊娠階段胎盤組織中CRMP-1的表達

CRMP-1定位于滋養(yǎng)細胞的胞漿，其著色呈黃色。正常妊娠組婦女胎盤組織中CRMP-1的蛋白表達水平隨著妊娠周期的增加呈下降趨勢，組間差異有統(tǒng)計學意義(Uc=28.508，P=0.000)；其中妊娠早期組婦女者胎盤組織強陽性表達率明顯高于妊娠晚期組，組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 正常妊娠組婦女不同妊娠階段胎盤組織中CRMP-1的表達強度比較[n(%)]

注：與妊娠早期組比較，*P<0.05；與妊娠中期組比較，#P<0.05。

2.2 早發(fā)型先兆子癇婦女胎盤組織中CRMP-1的表達

早發(fā)型先兆子癇組婦女胎盤組織CRMP-1表達水平明顯高于同階段正常妊娠對照組婦女，差異有統(tǒng)計學意義(Uc=8.866，P=0.031)。見表3。

圖1 不同妊娠階段孕婦胎盤組織CRMP-1表達情況(200×)

組別n-++++++對照組A198(42.11)6(31.58)4(21.05)1(5.26)早發(fā)型先兆子癇組303(10.00)9(30.00)10(33.33)8(26.67)

2.3 不同嚴重程度早發(fā)型先兆子癇婦女胎盤組織中CRMP-1表達水平比較

早發(fā)型先兆子癇輕度組和重度組婦女胎盤組織中CRMP-1水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(Uc=2.963，P=0.397)。見表4、圖2。

表4 不同嚴重程度早發(fā)型先兆子癇組婦女胎盤組織中CRMP-1表達水平比較

圖2 早發(fā)型先兆子癇不同嚴重程度孕婦胎盤組織CRMP-1表達情況(200×)

2.4 遲發(fā)型先兆子癇婦女胎盤組織中CRMP-1的表達

遲發(fā)型先兆子癇組婦女胎盤組織CRMP-1表達水平與同階段正常妊娠對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Uc=2.987，P=0.225)。見表5。

表5 遲發(fā)型先兆子癇組與同階段正常妊娠組婦女胎盤組織中CRMP-1表達水平比較

2.5 早發(fā)型先兆子癇與遲發(fā)型先兆子癇組婦女胎盤組織中CRMP-1表達水平比較

早發(fā)型先兆子癇組婦女胎盤組織中CRMP-1水平明顯高于遲發(fā)型先兆子癇組，差異有統(tǒng)計學意義(Uc=18.561，P=0.000)。見表6、圖3。

表6 早發(fā)型先兆子癇組與遲發(fā)型先兆子癇組婦女胎盤組織中CRMP-1表達水平比較

圖3早發(fā)型先兆子癇與遲發(fā)型先兆子癇組婦女胎盤組織中CRMP-1表達情況(200×)

3 討論

先兆子癇又稱子癇前期，根據(jù)發(fā)病時間以妊娠34周作為分界將其劃分為早發(fā)型先兆子癇和遲發(fā)型先兆子癇。近年來，臨床研究表明兩種先兆子癇類型的發(fā)病機制可能存在較大差別，可能屬于同一疾病不同生理階段的獨立存在體[7]。遲發(fā)型先兆子癇的發(fā)生率約占先兆子癇的80%，患者胎盤的形態(tài)學類似于健康妊娠者，多伴有胎兒生長受限，但對其影響相對較小，且隨著妊娠終止或產(chǎn)后多數(shù)孕婦的臨床癥狀及生化指標會逐漸恢復[8]。而早發(fā)型先兆子癇的發(fā)生率雖然遠低于遲發(fā)型先兆子癇，但其妊娠早中期即出現(xiàn)蛋白尿、高血壓癥狀，多伴有胎盤絨毛發(fā)育及血管形態(tài)的異常，病情更為嚴重，患者并發(fā)癥發(fā)生率遠高于遲發(fā)型先兆子癇，且對產(chǎn)婦的預(yù)后影響較大[9,10]。因此，探尋早發(fā)型先兆子癇的特異標志物對該類疾病的及早診斷及靶向治療意義重大。

CRMP-1屬于CRMP家族成員，是RAS抑癌基因下游蛋白Rho GTP酶的作用底物，主要存在于細胞膜內(nèi)側(cè)與脂筏結(jié)構(gòu)偶聯(lián)，通過調(diào)節(jié)微管聚合或解散，參與細胞骨架形成，調(diào)節(jié)細胞凋亡、分化、突起的坍塌等生物行為。CRMP-1最初發(fā)現(xiàn)于腦組織，被認為是腦特異性蛋白質(zhì)，其在神經(jīng)元樹突發(fā)育及形態(tài)構(gòu)建中發(fā)揮重要作用，研究表明其表達失調(diào)與癲癇發(fā)作具有密切相關(guān)性[11]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)CRMP-1能夠抑制腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移，其在癌組織中呈低表達，但其具體機制尚不清楚[12]。滋養(yǎng)層細胞來自胚胎，其具有與惡性腫瘤類似的高增殖和侵襲能力，滋養(yǎng)細胞的浸潤在妊娠早期胎盤植入、胎盤血管重塑及維持正常妊娠中發(fā)揮重要作用，推測CRMP-1可能在病理妊娠中發(fā)揮一定作用。

滋養(yǎng)細胞侵入到子宮脫膜進而侵入至子宮淺肌層，部分絨毛外滋養(yǎng)細胞侵入至血管內(nèi)，誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡并取代血管內(nèi)皮細胞，與血管周圍滋養(yǎng)細胞聯(lián)合，在擴大血管內(nèi)徑的同時，使子宮螺旋動脈重塑，維持正常妊娠[13,14]。本研究指出CRMP-1在妊娠胎盤的滋養(yǎng)層細胞中亦有表達，可能調(diào)節(jié)胎盤滋養(yǎng)細胞分化，介導胎盤植入。Lyall等[15]研究表明滋養(yǎng)細胞侵入障礙導致子宮胎盤螺旋動脈重塑受阻，進而導致子宮螺旋動脈管腔狹小，造成胎盤血流灌注量減少，與先兆子癇及胎兒生長受限的發(fā)生具有密切相關(guān)性。但目前極少有CRMP-1與先兆子癇相關(guān)病理機制的報道。本研究發(fā)現(xiàn)CRMP-1在正常妊娠及先兆子癇患者的胎盤滋養(yǎng)層中均有表達，其中妊娠早期胎盤組織中的表達水平較高，隨著妊娠周期的增長逐漸下降，同時觀察到早發(fā)型先兆子癇組孕婦胎盤組織CRMP-1表達水平明顯高于同妊娠階段健康孕婦，但在遲發(fā)型先兆子癇組并未觀察到CRMP-1與同妊娠階段健康孕婦的表達差異。提示CRMP-1的上調(diào)可能提高早發(fā)型先兆子癇的發(fā)生概率。但本研究另觀察到早發(fā)型先兆子癇輕度組與重度組患者胎盤組織中CRMP-1表達情況并無顯著差異，表明CRMP-1在早發(fā)型先兆子癇中的表達水平與疾病進展并無確切聯(lián)系，可能由于先兆子癇患者在妊娠早期階段滋養(yǎng)細胞浸潤過程中已存在CRMP-1蛋白的表達異常，進而影響胎盤著床及螺旋動脈血管重塑，而疾病后期發(fā)展過程中病情的加重可能是由其它因素造成的。

綜上所述，CRMP-1蛋白在妊娠階段胎盤滋養(yǎng)浸潤過程中發(fā)揮重要作用，其表達上調(diào)可導致滋養(yǎng)層細胞侵入受阻，進而使子宮螺旋動脈重塑發(fā)生障礙，導致早發(fā)型先兆子癇的發(fā)生，但其與遲發(fā)型先兆子癇的發(fā)生無確切相關(guān)性，具體作用機制有待后期進一步深入研究。