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(1.湖北工業(yè)大學,湖北武漢 430068; 2.江蘇省茶葉研究所,江蘇無錫 214000)

茶起源于中國西南地區(qū),是世界范圍內(nèi)最流行,消費最廣泛的飲料之一[1]。據(jù)報道,茶葉內(nèi)含物質可以預防多種疾病,如心血管疾病疾病[1],癌癥[2],抑郁癥[3],并有助于減輕體重[4]。多酚作為茶葉中主要生物活性物質,被廣泛報道在降低疾病風險方面發(fā)揮重要作用[5-6]。近年,來自植物中的多酚類化合物尤其是原花青素，因其獨特的生物活性受到廣泛關注[7-9]。原花青素是以黃烷-3-醇為基礎單元,通過C4-C8或C4-C6鍵連接的一類多酚類化合物,分為單體,低聚,高聚原花青素[10]。復雜的結構和不同的組成賦予了原花青素多種生物和生化特性。其存在于植物的許多器官和組織,以增加抗病能力,強化植物組織和限制微生物生長[11-13]。這些特性不僅體現(xiàn)在對植物的保護,同樣體現(xiàn)在對入體健康潛在的生物活性[14-16]。早在上世紀,研究入員就對茶葉中部分原花青素進行了初步研究[17],由于條件限制,目前研究者對不同茶葉尤其是特殊品種中茶葉內(nèi)低聚及高聚原花青素組分及生物活性知之甚少。

紫娟是一種高花青素茶樹品種,是中國西南大葉喬木古茶樹的變種。茶樹有紫色的芽,莖和葉子;淡紫色的果皮和花萼。據(jù)報道,紫娟提取物具有潛在的功效,如降血壓、降血糖、減肥[18-19],抑菌[20],預防炎癥[21]及治療阿爾茲海默病[22]等。迄今為止,紫娟中關于原花青素的含量,組分結構和其在紫娟功效中所扮演的角色罕見報道。大量報道稱,植物中的原花青素對α-淀粉酶具有較強的抑制活性,可以有效降低入體攝入葡萄糖的吸收率[23-25],具有成為糖尿病及減肥藥物的潛力。因此，本研究提取純化了紫娟花原花青素，測定了提取物中原花青素含量，采用UPLC-MS對紫娟原花青素組分進行鑒定，并評價其對α-淀粉酶的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫娟 采自江蘇宜興茶葉研究所玉山基地,經(jīng)過蒸青處理后烘干粉碎,過60目篩,于-5 ℃保存?zhèn)溆?甲醇、香草醛、濃硫酸、乙醇、磷酸鈉、氯化鈉、甲腈、二硝基水楊酸;AB-8大孔樹脂 上海一基實業(yè)有限公司;Sephadex LH-20 上海摩速科學器材有限公司;原花青素標準品 南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司;α-淀粉酶 ≥4000 U/g,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;EGCG 湖南三為生物科技有限公司。

GZX-9023臺式電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司;TD4C臺式低速自動平衡離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司;ME-T 分析天平 瑞士Mette公司;DK-320恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司;FD-1A-80真空冷凍干燥機 上海豫明儀器有限公司;UV-2350紫外光分光光度計 尤尼科儀器有限公司;DL-720E超聲波清洗機 上海之信儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;超高效液相色譜:Waters UPLC,檢測器:WATERS ACQUITY PDA,色譜柱:BEH C-18 2.1 mm×50 mm 1.7 μm,飛行時間質譜器:WATERS SYNAPT MS,Masslynx4.1,質譜色譜管理軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫娟原花青素粗提取 稱取紫娟樣品10.00 g放入500 mL錐形瓶中[4],加入300 mL的70%丙酮溶液，超聲20 min(功率300 W，頻率40 kHz),重復2次,將提取液放入離心機中，以3000 r/min的速度離心20 min,合并提取液,旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑后,冷凍干燥,獲得原花青素粗提物。

1.2.2 紫娟中原花青素粗提物純化 用50 mL純水將紫娟原花青素粗提物1.86 g溶解[4],將預處理好的樹脂濕法裝柱,以1.5 BV/h的速度讓原花青素提取液通過大孔樹脂柱至吸附飽和后,水洗至洗脫液為無色,用10%乙醇洗至洗脫液為無色,以去除部分雜質;再用70%丙酮洗脫,洗脫液經(jīng)真空旋轉蒸發(fā)濃縮、用水稀釋、冷凍真空干燥后,制得原花青素精制品粉末,冷藏備用。

1.2.3 原花青素定量分析 利用香草醛-硫酸比色法對原花青素進行定量分析[4,8-11]。分別配制1 g/100 mL的香草醛-甲醇溶液及50%硫酸溶液,將二者按體積比1∶1充分混勻,得工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。稱取原花青素標準品,以甲醇溶解,分別配置成0.2,0.3,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/mL的標準溶液,分別準確移取0.5 mL不同濃度的標準溶液于10 mL試管中,加入5 mL工作液,放入30 ℃的水浴鍋中避光反應15 min后，取出靜置至室溫。以甲醇為空白對照,于497 nm波長處測定吸光度,繪制標準曲線。取10 mg原花青素精制品粉末,用甲醇溶解定容至50 mL,移取0.5 mL不同濃度的標準溶液于10 mL試管中,加入5 mL工作液,放入30 ℃的水浴鍋中避光反應15 min后取出靜置至室溫,于497 nm波長處測定吸光度。

1.2.4 超高效液相色譜-質譜(UPLC-MS) 將1 g原花青素精制品粉末溶于30%甲醇,以1 BV/h的速度讓原花青素溶解液通過Sephadex LH-20柱至吸附飽和后,然后在預處理的Sephadex LH-20柱上用30%甲醇處理4 h,用30%甲醇洗滌直至洗脫液變成無色,洗脫酚酸,糖苷等物質,吸附的多酚部分隨后被70%丙酮水溶液(500 mL)洗脫,并旋轉蒸發(fā)在真空下除去有機溶劑,凍干干燥。后準確稱取10 mg樣品,用甲醇溶解定容至10 mL(現(xiàn)配現(xiàn)用),采用UPLC-MS法對紫娟原花青素進行定性分析[4]。

色譜條件:色譜柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;流動相:水(A)和乙腈(B);流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 洗脫梯度程序Table 1 Elution gradient procedure

質譜條件:電噴霧離子源,負離子模式;離子掃描范圍m/z 200～1200;霧化氣溫度350 ℃;電噴霧電壓-4000 V;源內(nèi)碎裂電壓135 V。

1.2.5α-淀粉酶抑制活性的測定 分別配制0.25 mL的0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液,0.5 mg/mLα-淀粉酶溶液和0.5 mL不同濃度的紫娟原花青素精制品溶液及EGCG溶液(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL),在37 ℃下反應10 min[4]。反應后,在每個試管中加入0.5 mL的1%淀粉溶液,混合物在37 ℃下反應10 min,反應用1.0 mL二硝基水楊酸試劑停止,然后將試管放入沸水浴中5 min并冷卻至室溫。反應混合物加入10 mL蒸餾水,采用紫外-可見分光光度計在540 nm測量。將阿卡波糖磨成粉末采用超聲法制成溶液作為對照。應用下列公式計算對α-淀粉酶的抑制活性。

I(%)=(V空白-V樣品)/V樣品×100

式中:I為抑制劑對α-淀粉酶的抑制率(%),V空白為未添加抑制劑的空白實驗組反應速度(mg/min);V樣品為添加了待測抑 制劑樣品的反應速度(mg/min)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個樣品設3個平行,采用Origin 8.0和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。測定結果以平均值±標準差表示。實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進行鄧肯氏(Duncan’s)差異分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 紫娟原花青素定量分析

從紫娟中提取出原花青素粗制品如1.2.1所述,提取率為18.6%(干重)。使用AB-8大孔吸附樹脂柱進一步純化紫娟原花青素,得到1.18 g精制品。以A497值(Y)和原花青素標準品濃度(X)作回歸方程為:y=8.7363x+0.4248,R2=0.9993。紫娟原花青素精制品以此標準曲線測定(圖1),純度達93%,表明紫娟茶中含有大量原花青素。

圖1 原花青素分光光度標準曲線Fig.1 Curve of spectrophotometric spectrophotometry

2.2 紫娟原花青素的UPLC-ESI-MS分析

紫娟原花青素UPLC色譜圖如圖2所示,通過UPLC-ESI-MS在負離子模式下分析,結果總結在表2中。在紫娟原花青素中,至少有3種單體和7種原花青素低聚物被檢測并鑒定。相較于聚合的原花青素,單體原花青素(也被稱為兒茶素,如:C,EC,GC,EGC,ECG,EGCG)更加豐富。原花青素單體主要由表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG),表兒茶素沒食子酸酯(EGC)和表沒食子兒茶素(ECG)組成,其相對分子質量為458和442。原花青素單體還包括(+)-兒茶素(C),(-)-表兒茶素(EC)和沒食子兒茶素(CG),其相對分子質量為290和 306,這些單體相應的準分子離子[M-H]-m/z分別為:457,441,289,305。各單體通過C4-C6或C4-C8鍵相連,形成二聚體、三聚體、四聚體等多聚體。

圖2 紫娟原花青素精制品的超高效液相色譜圖Fig.2 Zijuan proanthocyanidins products by ultra-high performance liquid chromatography

對單體來說,二聚體的分離比較困難,其對應的質譜數(shù)據(jù)也較復雜,除推斷出準分子離子外,還必須提供了一系列碎片離子信息。從表2中m/z 761,m/z 745,m/z 729,m/z 865,m/z 881,m/z 609和m/z 593的質譜數(shù)據(jù)可以得出,二聚體至少有7種,保留時間分別為 4.46、6.39、7.28、7.50、8.53、8.62、9.40,根據(jù)準分子離子數(shù)據(jù),推斷這些二聚體均為B型原花青素二聚體,并且有6種屬于酯、棓型二聚體原花青素,與許多傳統(tǒng)原花青素提取植物如葡萄籽相比,如此多種類的酯、棓型二聚體原花青素是罕見的。以下是原花青素在質譜中裂解的主要模式。

原花青素聚合體的碎裂方式主要包括黃烷醇間連接鍵的斷裂(QM)、逆狄爾斯-阿德(RAD)反應和雜環(huán)裂解(HRF)反應。HRF反應為聚合體失去1個相對分子質量126的中性分子。RAD反應是黃烷醇C-環(huán)上發(fā)生斷裂,失去1個相對分子質量為152的中性的結構(C8H8O3)。黃烷醇間斷裂(QM)有2種可能,一種是失去僅以C4鍵與其他單元相連頂部單元T-unit(TOP)中性碎片,形成m/z為288的離子;另一種可能是失去以C6或C8鍵與其他單元相連的底部單元B-unit(BASE),形成m/z為290的碎片片段。

2.2.1 二聚體m/z 761結構解析 由表2可知,m/z 761二級質譜碎片離子為125,305,423,591。碎片離子m/z 591為m/z 761通過RAD反應裂解產(chǎn)生m/z 609,m/z 609進一步脫水生成m/z 591;碎片離子m/z 423為m/z 761通過RAD 反應裂解產(chǎn)生m/z 609,m/z 609通過RAD 反應裂解產(chǎn)生m/z 441,進一步脫水生成m/z 423;碎片離子m/z 305為m/z 761通過RAD 反應裂解產(chǎn)生m/z 609,m/z 609發(fā)生QM裂解類黃酮連接鍵產(chǎn)生的;碎片離子m/z 125為HRF反應為聚合體失去的中性分子?？赏茰y其結構為(E)GC-(E)GCG二聚體,其同分異構體共4種,結構式如圖3所示。

圖3 二聚體m/z 761可能結構式Fig.3 Dimer m/z 761 possible structural formula

2.2.2 二聚體m/z 745結構解析 由表2可知,m/z 745二級質譜碎片離子為169,407,423,593。碎片離子m/z 593為m/z 745通過RAD反應裂解產(chǎn)生m/z 593;碎片離子m/z 423產(chǎn)生方式同上;m/z 407為m/z 745通過RAD反應裂解產(chǎn)生m/z 593,m/z 593的T單元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生m/z 425,由m/z 425中B環(huán)相鄰酚羥基脫水產(chǎn)生。可推測其結構為(E)CG-(E)GC二聚體,其同分異構體共4種,結構式如圖4所示。

表2 紫娟原花青素的分析Table 2 Analysis of proanthocyanidin from Zijuan

圖4 二聚體m/z 745可能結構式Fig.4 Dimer m/z 745 possible structural formula

2.2.3 二聚體m/z 729結構解析 由表2可知,m/z 729二級質譜碎片離子為125,245,407,577。碎片離子m/z 577為m/z 729通過RAD反應裂解產(chǎn)生m/z 577;m/z 407為m/z 729通過RAD 反應裂解產(chǎn)生m/z 577,m/z 577的T單元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生m/z 425,由m/z 425中B環(huán)相鄰酚羥基脫水產(chǎn)生。m/z 245由m/z 729發(fā)生QM裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 289,后脫二氧化碳產(chǎn)生;可推測其結構為(E)C-(E)CG二聚體,其同分異構體共4種,結構式如圖5所示。

圖5 二聚體m/z 729可能結構式Fig.5 Dimer m/z 729 possible structural formula

2.2.4 三聚體m/z 865結構解析 由表2可知,m/z 865二級質譜碎片離子為125,407。m/z 407是由原花青素三聚體分子離子m/z 865發(fā)生QM裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 577,m/z 577發(fā)生RDA裂解生成m/z 425再脫水生成m/z 407;碎片離子m/z 125為HRF反應為聚合體失去的中性分子?？赏茰y其結構為三單元兒茶素或表兒茶素三聚體,其同分異構體共8種,如圖6所示。

圖6 三聚體m/z 865可能結構式Fig.6 Dimer m/z 865 possible structural formula

2.2.5 二聚體m/z 881結構解析 由表2可知,m/z 881二級質譜碎片離子為169,407,577。m/z 577是由原花青素二聚體分子離子m/z 881發(fā)生QM裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 577,m/z 407是由m/z 577發(fā)生RDA裂解生成m/z 425再脫水生成。可推測其結構為ECG-ECG,如圖7所示。

圖7 二聚體m/z 881可能結構式Fig.7 Trimer m/z 881 possible structural formula

2.2.6 二聚體m/z 609結構解析 由表2可知,m/z 609二級質譜碎片離子為125,305,423。碎片離子m/z 423為m/z 609通過RAD 反應裂解產(chǎn)m/z 441,進一步脫水生成m/z 423;m/z 305是由m/z 609發(fā)生QM裂解類黃酮連接鍵產(chǎn)生的;碎片離子m/z 125為HRF反應為聚合體失去的中性分子?？赏茰y其結構為(E)GC-(E)GC,如圖8所示。

圖8 二聚體m/z 609可能結構式Fig.8 Trimer m/z 609 possible structural formula

2.2.7 二聚體m/z 593結構解析 由表2可知,m/z 593二級質譜碎片離子為289,305,407,423。碎片離子m/z 423為m/z 593通過RAD 反應裂解產(chǎn)m/z 441,進一步脫水生成;;m/z 441是由 m/z 593的B單元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生,m/z 425由 m/z 593的T單元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生;m/z 423由m/z 441中B環(huán)相鄰酚羥基脫水產(chǎn)生;m/z 289與305是由m/z 593發(fā)生QM類黃酮連接鍵產(chǎn)生的。可推測其結構為(E)C-(E)GC,如圖9所示。

圖9 二聚體m/z 593可能結構式Fig.9 Trimer m/z 593 possible structural formula

對于分子量大于1000的原花青素,很難進行準確的定性分析,質譜圖中各個聚合物的分子離子峰的強度并不一定真實的反映聚合物分子在原花色素混合物中的組成情況,這是因為不同結構的原花色素離子化效率不同,分子量較小的聚合物離子化后的產(chǎn)物更快到達檢測器,從而使得混合物中相同比例的小分子和高分子沒有相等的離子峰強度,高分子甚至不出峰[26]。

2.3 紫娟原花青素精制品對α-淀粉酶活性的抑制效果

原花青素,EGCG和阿卡波糖對α-淀粉酶抑制效果如圖10所示,原花青素,阿卡波糖和EGCG對α-淀粉酶的IC50值分別為(0.7±0.02)、(0.9±0.01)、(2.0±0.01) mg/mL。所有樣品的抑制率都隨著濃度的增加而增加。在測試樣品中原花青素體現(xiàn)了與阿卡波糖類似的抑制活性。EGCG較原花青素精制品和阿卡波糖相比效果較差,根據(jù)UPLC液相圖譜及文獻[5,9],我們可以推斷EGCG是原花青素中最主要的成分,據(jù)文獻[4,8-11]報道原花青素單體對α-淀粉酶抑制效果較弱,多聚原花青素抑制活性要高于原花青素單體,由此我們可以推測多聚原花青素α-淀粉酶活性抑制效果要高于原花青素單體,并有潛力可以取代阿卡波糖成為新型治療糖尿病的藥物,但是本次為體外實驗,考慮到入體吸收,體內(nèi)環(huán)境及多種因素,后續(xù)可以進行更為詳盡的實驗。

圖10 阿卡波糖、EGCG和原花青素精制品抑制活性比較圖Fig.10 Comparison of inhibitory activity of acarbose,EGCG and procyanidins

3 結論

紫娟茶中含有大量的原花青素,有3種單體和7種原花青素低聚物被檢測并鑒定,絕大多數(shù)是酯、棓型原花青素二聚體。相較于聚合的原花青素,單體原花青素更為豐富。原花青素對α-淀粉酶抑制作用隨濃度而增大。本研究結果表明，從紫娟中分離出的原花青素具有有效的α-淀粉酶抑制活性,較傳統(tǒng)藥物阿卡波糖有更好的抑制效果,有成為抗糖尿病及減肥藥物的潛力。