繆曉剛，阿布都艾尼·熱吾提，王利，瓦熱斯江·尼亞孜，郭子剛，王浩

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心創(chuàng)傷病區(qū)，新疆 烏魯木齊 830001)

骨肉瘤也叫成骨肉瘤，是最常見的骨惡性腫瘤，常發(fā)生在20歲以下的青少年或者兒童[1]。骨肉瘤多見于長骨干骺端，約3/4發(fā)生在股骨下端及脛骨上端，極少數(shù)發(fā)生在手和足等四肢末端骨。骨肉瘤預(yù)后較差，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，5年生存率可達(dá)70%左右；而轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)患者5生存率低于20%[2-3]。因此，針對骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究將為該病的治療提供新的分子標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)?；|(zhì)金屬蛋白酶11(matrix met alloproteinase-11，MMP-11)是MMP家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)其與多種人類腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，對腫瘤的分子治療有重要的參考價(jià)值[4-5]。Nonsrijun等[6]發(fā)現(xiàn)MMP-11的表達(dá)與前列腺癌預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)MMP-11患者提示預(yù)后不良；Yan等[7]報(bào)道低表達(dá)MMP-11胃癌患者5年生存率較高表達(dá)MMP-11患者明顯升高；Hsin等[8]揭示MMP-11在舌癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，過表達(dá)MMP-11可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲；此外Iwasaki等[9]報(bào)道過表達(dá)MMP-11可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于MMP-11在骨肉瘤的研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究旨在檢測MMP-11在骨肉瘤和癌旁組織中的表達(dá)特征，并探究敲低其表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集 2012年1月至2014年12月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨科中心收集40例骨肉瘤及配對的癌旁骨組織標(biāo)本，每一例標(biāo)本均經(jīng)本院病理科進(jìn)行病理確診。標(biāo)本的收集經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)認(rèn)可并獲得患者知情同意。40例標(biāo)本中男性20例，平均年齡(52.61±3.42)歲；女性20例，平均年齡(51.77±4.58)歲。

1.2 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 總RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司。選取液氮保存的40例配對骨肉瘤及癌旁組織，依照Trizol試劑盒說明書，提取組織中的總RNA。遵照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明將l μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，隨后放置-80℃保存。

1.3 熒光定量PCR(Quantitative RT-PCR) 參照SYBR?Premix EX TaqTM ⅡPCR Kit試劑盒說明書，以合成的cDNA作為模版在LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體系為：模版cDNA 1 μL，2×SYBR?Premix Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNase-free water 8 μL。MMP-11上游引物為5’-TGGGATAGACACCAATGAGATT-3’，下游引物為5’-AGCCCGCTTTGAAGAA-3’；以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物為5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游引物為5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。反應(yīng)條件為：98℃ 10 min，隨后98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡 參照RIPA(radio-immunoprecipitation assay)蛋白裂解試劑說明書，提取骨肉瘤細(xì)胞的總蛋白。采用BCA(bicinchoninic acid)定量試劑盒將提取好的總蛋白定量到2 μg/μL，按比例加入5×SDS上樣緩沖液，105 ℃加熱15 min使其完全變性。常規(guī)制備10% SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量25 μL，隨后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入抗MMP-11(ab119284，1︰1 000稀釋)及GAPDH抗體(ab8245，1︰2 000稀釋)，4℃過夜并室溫孵育相應(yīng)的二抗1 h，隨后使用TBST(tris-buffered saline with tween 20)洗滌3次，ECL(electro-chemi-luminescence)發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片。

1.5 免疫組化染色 骨肉瘤及癌旁骨組織石蠟切片采用0.25% H2O2液處理20 min脫蠟。山羊血清于37℃孵育30 min后，加抗MMP-11兔多克隆抗體，后置于4℃冰箱過夜。加入生物素標(biāo)記的二抗在37℃孵育60 min，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素孵育30 min，最后DAB顯色約1 min，顯微鏡下觀察。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 骨肉瘤細(xì)胞系(HOS和Saos-2)購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清FBS均購自美國Invitrogen公司。細(xì)胞采用DMEM+10%FBS在37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。MMP-11 siRNA及陰性對照(siRNA control)合成于上海吉瑪基因公司。取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行鋪板，采用Lipofetamine 3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，其中試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA，陰性對照組轉(zhuǎn)染siRNA control。48 h后收集細(xì)胞，提取RNA和蛋白質(zhì)，采用熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡觀察兩組細(xì)胞中MMP-11的表達(dá)變化。

1.7 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT) 取對數(shù)期生長的骨肉瘤細(xì)胞按照96孔板進(jìn)行鋪板，并使每孔細(xì)胞數(shù)達(dá)到6 500個(gè)。試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA，陰性對照組轉(zhuǎn)染siRNA control，并連續(xù)4 d每天每孔加入15 μL MTT (5 mg/mL，Sigma，USA)與細(xì)胞共孵育4 h后棄上清，最后使用150μL二甲基亞砜(DMSO，Sigma，USA)溶解，并測各孔480 nm波長的吸光度。

1.8 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 取對數(shù)期生長的骨肉瘤細(xì)胞按照6孔板進(jìn)行鋪板，并使每孔細(xì)胞數(shù)約為3.0×105個(gè)。當(dāng)細(xì)胞完全貼壁后，用10μL槍頭按比例劃出4條橫線。隨后，試驗(yàn)組轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA，陰性對照組轉(zhuǎn)染siRNA control，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后每隔4 h進(jìn)行拍照，觀察和測定劃痕寬度。

1.9 流式細(xì)胞儀技術(shù) 將對數(shù)期生長細(xì)胞使用6孔板進(jìn)行鋪板，并轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA或siRNA control 48 h后參照AnnexinV FITC試劑盒說明書(invitrogen，USA)處理細(xì)胞，隨后采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-11在骨肉瘤及配對的癌旁組織表達(dá)特征 經(jīng)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中MMP-11 mRNA的表達(dá)量較癌旁組織明顯升高，以癌旁組織中MMP-11 mRNA的表達(dá)量為(1.0±0.22)，則其在骨肉瘤組織中相對表達(dá)量為(3.94±0.79)(P<0.05)。免疫組化染色亦顯示MMP-11蛋白在骨肉瘤組織的陽性率顯著高于癌旁組織(見圖1，P<0.05)。

圖1 免疫組化染色檢測MMP-11在骨肉瘤及配對的癌旁組織的表達(dá)強(qiáng)度(×200)

2.2 體外轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)源性MMP-11表達(dá)的影響 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA后HOS和Saos-2細(xì)胞中MMP-11 mRNA的表達(dá)水平分別為siRNA control組的(0.22±0.12)倍和(0.46±0.15)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡亦顯示轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA后HOS和Saos-2細(xì)胞中MMP-11蛋白的表達(dá)水平分別為siRNA control組的(0.17±0.09)倍和(0.41±0.16)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2，P<0.05)。上述結(jié)果表明，MMP-11 siRNA可有效降低骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)源性MMP-11表達(dá)水平。

圖2 體外轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)源性MMP-11蛋白表達(dá)的影響

2.3 體外轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞增殖曲線顯示，MMP-11 siRNA轉(zhuǎn)染組骨肉瘤細(xì)胞增殖速度較siRNA control組明顯降低，轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA 2和3 d后HOS細(xì)胞生長抑制率分別為(13.52±5.24)%和(18.66±6.55)%(見圖3，P<0.05)；Saos-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA 1、2和3 d后細(xì)胞生長抑制率分別為(9.39±3.72)%、(15.43±4.86)%和(21.57±7.01)%(見圖3，P<0.05)。

注：*為P<0.05

2.4 體外轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細(xì)胞遷移的影響 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察敲低MMP-11對骨肉瘤細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果見圖4。轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA 24 h后HOS細(xì)胞劃痕閉合約(36.23±11.56)%，而轉(zhuǎn)染siRNA control 24 h后HOS細(xì)胞劃痕閉合約(78.19±15.71)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA 24 h后Saos-2細(xì)胞劃痕閉合約(31.55±7.26)%，而轉(zhuǎn)染siRNA control 24 h后Saos-2細(xì)胞劃痕閉合約(89.65±21.86)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 體外轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細(xì)胞遷移的影響

2.5 體外轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 MMP-11 siRNA組HOS細(xì)胞的凋亡率為(7.78±3.31)%，而siRNA control組HOS細(xì)胞的凋亡率為(3.12±1.09)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MMP-11 siRNA組Saos-2細(xì)胞的凋亡率為(10.63±3.90)%，而siRNA control組Saos-2細(xì)胞的凋亡率為(2.57±1.41)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix met alloproteinases，MMPs)是一類依賴Zn2 +離子的內(nèi)肽酶家族，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs可參與多種生理及病理過程，包括結(jié)構(gòu)重塑、基質(zhì)降解、炎性反應(yīng)、細(xì)胞生長及血管生成等[12-13]。目前MMPs根據(jù)底物和結(jié)構(gòu)域可劃分為5大類：明膠酶、膠原酶、膜型金屬蛋白酶、間質(zhì)溶解素及類膜基質(zhì)蛋白酶。近年來，MMPs在腫瘤中的研究日益增多，并發(fā)現(xiàn)其與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、浸潤及預(yù)后密切相關(guān)[10]。例如，MMP-7可降解細(xì)胞膜上的死亡配體，進(jìn)而抑制死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[14]；MMP-2和MMP-9的表達(dá)在浸潤性乳腺癌組織顯著高于癌旁組織和良性病變組織[15]；結(jié)腸癌組織中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平及陽性率均顯著高于癌旁正常組織[16]；此外低表達(dá)MMP-10宮頸癌患者預(yù)后明顯好于高表達(dá)MMP-10患者[17]。

MMP-11是MMPs中的一員，研究發(fā)現(xiàn)其與多種人類腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，對腫瘤的分子治療有重要的參考價(jià)值。目前關(guān)于MMP-11在骨肉瘤的研究尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以MMP-11為主要研究對象，通過采用熒光定量PCR和免疫組化染色分析我院骨科中心40例骨肉瘤及癌旁組織中MMP-11的表達(dá)特征，首次發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中MMP-11 mRNA和蛋白的表達(dá)量較癌旁組織明顯升高，上述結(jié)果與MMP-11在其他腫瘤組織的表達(dá)相符，提示高表達(dá)MMP-11在骨肉瘤中可能發(fā)揮促癌作用。

為了證實(shí)上述科學(xué)假設(shè)，我們委托上海吉瑪基因公司合成MMP-11小干擾RNA(siRNA)和陰性對照(siRNA control)，并體外轉(zhuǎn)染至骨肉瘤細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染MMP-11 siRNA可有效降低骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)源性MMP-11 mRNA和蛋白表達(dá)水平，提示MMP-11 siRNA可靶向敲低MMP-11的表達(dá)，進(jìn)一步用于觀察其對骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響。隨后MTT、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，敲低MMP-11的表達(dá)可顯著抑制HOS和Saos-2細(xì)胞的增殖及遷移能力，并增加細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果強(qiáng)烈提示高表達(dá)MMP-11作為致癌基因促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MMP-11在骨肉瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并初步揭示敲低MMP-11的表達(dá)可顯著抑制HOS和Saos-2細(xì)胞的增殖及遷移能力，并增加細(xì)胞凋亡，提示高表達(dá)MMP-11在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用。