郭玉丹 杜迎春 何亞鵬 時(shí) 曉 賈 斌

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心，北京 102101）

細(xì)鱗魚(yú)（Brachymystax lenok）屬鮭形目，鮭科，細(xì)鱗魚(yú)屬，是我國(guó)名貴的陸封型冷水魚(yú)。1988年，細(xì)鱗魚(yú)被列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物名錄。近年來(lái)野生細(xì)鱗魚(yú)分布范圍逐漸縮小，野生種群急劇衰退，北京已經(jīng)瀕臨滅絕。

為了恢復(fù)細(xì)鱗魚(yú)這一珍稀的瀕危物種，人們陸續(xù)開(kāi)展了細(xì)鱗魚(yú)的馴養(yǎng)、繁育及增殖放流工作，并取得了初步的成功。但在細(xì)鱗魚(yú)的人工馴養(yǎng)過(guò)程中，各種疾病頻發(fā)，尤其是各類(lèi)細(xì)菌性疾病高發(fā)，一旦發(fā)病很難根治，經(jīng)常會(huì)造成毀滅性后果，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此，在馴養(yǎng)繁育中，迫切需要一種快捷、簡(jiǎn)便的方法對(duì)病源菌進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的診斷，對(duì)疫病進(jìn)行早期預(yù)防和治療。

本研究的目的就是將LAMP技術(shù)應(yīng)用到細(xì)鱗魚(yú)細(xì)菌性疾病的診斷中來(lái)，建立一種快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌株 嗜水氣單胞菌,由北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心分離培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)儀器 PCR擴(kuò)增儀（上海依科賽生物制品有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司），凝膠成像儀（上海依科賽生物制品有限公司），超純水系統(tǒng)（優(yōu)普）1.3 試驗(yàn)試劑 細(xì)菌微量生化鑒定管（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），藥敏紙片（北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），BstDNA鏈置換聚合酶及緩沖液Buffer（美國(guó)紐英倫生物技術(shù)），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司出品），SYBER Green I核酸染料（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌DNA的提取 利用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，對(duì)待測(cè)菌株的新鮮純培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)菌總DNA 提取（按說(shuō)明書(shū)操作）。

2.2 LAMP引物的設(shè)計(jì)合成 NCBI上公布的嗜水氣單胞菌pilin基因序列設(shè)計(jì)引物，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/e/）設(shè)計(jì)完成（表1）。設(shè)計(jì)好的引物提交華大公司進(jìn)行合成。

2.3 LAMP反應(yīng)體系的建立 外引物的反應(yīng)濃度為5 pmol，內(nèi)引物的濃度為40 pmol，環(huán)引物的濃度為40 pmol。緩沖液的濃度為2.5 mol/L,鎂離子的濃度為150 mmol/L，dNTP的濃度為10 mmol/L，BstDNA鏈置換聚合酶的濃度為8 U，模板為2 μL，補(bǔ)加去離子水至25 μL（表2）。63.5 ℃水浴鍋孵育，然后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 嗜水氣單胞菌（Ah-1）LAMP引物序列

表2 LAMP方法的反應(yīng)體系

2.4 LAMP反應(yīng)的特異性分析 利用設(shè)計(jì)合成的LAMP引物為模板；同時(shí)利用殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌其他3種單胞菌作為模板檢測(cè)LAMP引物的特異性。同時(shí)，設(shè)置以ddH2O為模板的陰性對(duì)照。

2.5 LAMP反應(yīng)的靈敏性分析 利用外引物F3和B3，擴(kuò)增嗜水氣單胞菌的Pilin基因。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后，用ND2000超微量核酸分析儀測(cè)其DNA濃度。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)鶆蛳♂尦?0-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10。 分 別 用 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2濃度的 DNA 為模板，并設(shè)置ddH2O為陰性對(duì)照。進(jìn)行LAMP靈敏性試驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 LAMP方法的特異性 利用嗜水氣單胞菌的Pilin基因設(shè)計(jì)的LAMP引物進(jìn)行特異性分析。Pilin引物能夠特異性擴(kuò)增嗜水氣單胞菌的靶基因見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照均沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，表明引物特異性良好。

圖1 嗜水氣單胞菌（Ah-1）LAMP方法的特異性

結(jié)果顯示：嗜水氣單胞菌株反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性（+），肉眼觀察反應(yīng)物呈黃色。殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌等3株其他對(duì)照菌株反應(yīng)為陰性（－），反應(yīng)物呈橙色（染料本身的顏色）；ddH2O對(duì)照亦是陰性（－）。說(shuō)明嗜水氣單胞菌LAMP方法的特異性良好。

3.2 LAMP方法的靈敏性 利用ND2000核酸分析儀檢測(cè)Pilin的原始DNA濃度。對(duì)DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋以后，分別用 10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2濃度的DNA為模板，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，然后檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 嗜水氣單胞菌（Ah-1）LAMP方法的靈敏性

結(jié)果顯示，在63.5 ℃的恒溫條件下，嗜水氣單胞菌最小檢出濃度是10-6ng/μL。

3.3 討論 嗜水氣單胞菌是細(xì)鱗魚(yú)馴養(yǎng)繁育中的高發(fā)致病菌，一旦發(fā)病，難以根治，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致重大的經(jīng)濟(jì)損失。在細(xì)鱗魚(yú)的人工馴養(yǎng)中，迫切需要一種快捷、簡(jiǎn)便的方法對(duì)病源菌進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的診斷，用于疫病的早期預(yù)防和治療。

本研究將LAMP技術(shù)運(yùn)用到嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)中來(lái)。篩選嗜水氣單胞菌的Pilin基因設(shè)計(jì)特異性LAMP引物，在63.5 ℃的恒溫條件下，嗜水氣單胞菌的最小檢出濃度分別為是10-6ng/μL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法特異性好，靈敏度高，可將病源的檢測(cè)時(shí)間控制在1 d以內(nèi)。該方法所需儀器簡(jiǎn)單，1臺(tái)水浴鍋或恒溫箱就能完成反應(yīng)。結(jié)果通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)沉淀的顏色即可進(jìn)行判定，特別適合基層疫病的快速診斷，具有非常實(shí)用的應(yīng)用價(jià)值。