劉樂天 毛立民 王海俠 黃宇思

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，約占口腔惡性腫瘤的90%，是具有不同分化程度的鱗狀上皮性惡性腫瘤，具有較高的侵襲性和早期廣泛淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向。當(dāng)前治療口腔鱗癌的以手術(shù)、放療和化療為主的綜合序列治療，雖然取得了一定程度的進(jìn)步，但并未顯著提高口腔鱗癌患者特別是已發(fā)生局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤患者的五年生存率。因此，尋找新的可能與口腔鱗癌有關(guān)的生物標(biāo)志物，闡明其侵襲和轉(zhuǎn)移的機制，對于口腔鱗癌的防治具有積極意義。

富含絲氨酸/精氨酸剪接因子1（SRSF1）是SR蛋白家族的重要成員，參與前體蛋白mRNA的多種生理過程和腫瘤相關(guān)基因剪接的調(diào)控，通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[1]。其參與調(diào)節(jié)相當(dāng)多的生物學(xué)途徑，包括mRNA的剪接、穩(wěn)定和翻譯，miRNA的加工，蛋白質(zhì)的SUMO化和核仁應(yīng)激反應(yīng)等[2]，是第一個被證實與腫瘤直接相關(guān)的剪接因子[3]。caspase-3是caspase蛋白酶家族的重要成員，無論是內(nèi)源性還是外源性凋亡途徑，均需通過激活caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是凋亡執(zhí)行的重要效應(yīng)因子。目前關(guān)于SRSF1在口腔鱗癌中的表達(dá)及意義尚未見報導(dǎo)，其在口腔鱗癌中的表達(dá)機制及其與caspase-3蛋白在口腔鱗癌中的表達(dá)及相互作用亦不明確。本研究旨在通過檢測SRSF1及caspase-3在口腔鱗癌中的表達(dá)情況，探討二者在口腔鱗癌發(fā)生及發(fā)展中的作用及二者之間的相關(guān)性，為口腔鱗癌的臨床診斷、治療和判斷腫瘤預(yù)后提供理論依據(jù)。

資料和方法

1.一般資料

所有標(biāo)本均來自2016年10月到2017年12月之間的哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的經(jīng)口腔頜面外科手術(shù)中切取的組織標(biāo)本（福爾馬林固定，石蠟包埋），標(biāo)本均經(jīng)兩名病理科醫(yī)師雙盲法閱片明確診斷結(jié)果。共69例口腔鱗癌病例，男49例，女20例，其中舌來源28例、牙齦12例，口底11例，唇6例，頰5例，其他來源6例，男49例，女20例。高分化鱗癌23例，男14例，女9例，年齡43～75歲；中分化鱗癌23例，男15例，女8例，年齡35～83歲；低分化鱗癌23例，男20例，女3例，年齡42～73歲。從口腔外科其他手術(shù)切取的正?？谇火つそM織10例，男6例，女4例。4組年齡、性別比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.方法

（1）主要試劑：兔抗人SRSF1蛋白多克隆抗體、兔抗人caspase-3多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

（2）檢測方法：免疫組織化學(xué)SP法，一抗稀釋度經(jīng)預(yù)實驗檢測均為1:200，用SP法免疫組化試劑盒操作，操作步驟根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行，每組實驗均以PBS代替一抗作為陰性對照。

（3）結(jié)果判定：SRSF1蛋白染色陽性細(xì)胞為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃（褐）色，caspase-3蛋白染色陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃（褐）色。每張切片在高倍鏡視野下計數(shù)細(xì)胞，按染色強度打分：0分為無色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。按陽性細(xì)胞百分比打分：陰性記0分，陽性細(xì)胞1%～10%記1分，11%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分。染色強度與陽性細(xì)胞百分比的乘積≥3分為免疫反應(yīng)陽性。

3.統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用χ2檢驗和四格表的精準(zhǔn)概率法判斷SRSF1和caspase-3表達(dá)與各病理指標(biāo)的相互關(guān)系，采用Spearman法分析SRSF1及caspase-3表達(dá)的相關(guān)性，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.SRSF1蛋白檢測結(jié)果

SRSF1蛋白主要定位于細(xì)胞核，在光鏡下可見癌組織內(nèi)細(xì)胞核呈不同程度的棕黃顆粒。SRSF1蛋白在OSCC和正常口腔黏膜上皮中的陽性表達(dá)率分別為75.4%（52/69）和40%（4/10）。兩者之間的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SRSF1蛋白在低分化鱗癌中的陽性率95.7%（22/23）高于中分化鱗癌的陽性率69.6%（16/23），而后者的陽性率高于高分化鱗癌60.9%（14/23），在三種病理分級的組織中表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SRSF1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率為92%（23/25），高于未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的陽性率65.9%（29/44），其表達(dá)與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）見表1。SRSF1在OSCC組織中的陽性表達(dá)情況見圖1。

圖1 SRSF1在口腔鱗癌組織中的陽性表達(dá)（DAB，×200 ×400）

表1 SRSF1在口腔鱗癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.caspase-3蛋白檢測結(jié)果

Caspase-3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在光鏡下可見陽性表達(dá)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)呈不同程度的棕黃顆粒。其在OSCC和正?？谇火つど掀ぶ械年栃员磉_(dá)率分別為 31.9%（22/69）和 90.0%（10/69），兩者之間的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Caspase-3蛋白表達(dá)與腫瘤的病理分級有關(guān)（P＜0.05），在低分化鱗癌中的陽性率13.0%（3/23）低于中分化鱗癌的陽性率30.4%（7/23），而后者的陽性率低于高分化鱗癌52.2%（12/23）。經(jīng)檢測，caspase-3蛋白的表達(dá)與腫瘤是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計學(xué)關(guān)系（P＞0.05）見表2。Caspase-3在OSCC組織中的陽性表達(dá)情況見圖2。

圖2 caspase-3在OSCC組織中的陽性表達(dá)（DAB，×200 ×400）

表2 caspase-3在口腔鱗癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3.SRSF-1與caspase3表達(dá)的相關(guān)性

52例SRSF1表達(dá)陽性的OSCC組織中有36例Caspase3表達(dá)陰性（36/52，69.2%），而 17例 SRSF1表達(dá)陰性組織中有10例Caspase-3陽性表達(dá)（10/17，58.8%），兩種蛋白表達(dá)均為陽性16例，兩種蛋白表達(dá)均為陰性7例，進(jìn)行相關(guān)性分析（Pearson相關(guān)系數(shù) r＝-0.249，P＝0.039，P＜0.05） 見表 3，提示OSCC組織中SRSF1與Caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

表3 口腔鱗癌中SRSF1與caspase-3表達(dá)的關(guān)系

討 論

富含絲氨酸/精氨酸蛋白即SR蛋白是一組參與基因組成性剪接和選擇性剪接的系統(tǒng)發(fā)育保守的蛋白質(zhì)家族[4]。其在基因表達(dá)各個步驟的相互作用中起到了額外的作用[5]。絲氨酸/精氨酸剪接因子1（SRSF1，也稱為SF2/ASF）是剪接調(diào)節(jié)劑的SR蛋白家族的成員。其在維持細(xì)胞的基本生命活力方面發(fā)揮重要作用。同時，SRSF1可以通過識別和結(jié)合外顯子剪接增強子（ESE）來調(diào)節(jié)選擇性剪接，近年來的研究表明其參與調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性、輸出、無義介導(dǎo)的mRNA衰減、翻譯和miRNA的加工[6]。SRSF1調(diào)節(jié)選擇性剪接事件被認(rèn)為有助于腫瘤的發(fā)生。其在惡性腫瘤中可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的運動和侵襲，可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。同時，SRSF1的失活或丟失會導(dǎo)致G2期細(xì)胞周期停滯和程序性細(xì)胞死亡，對于維持腫瘤的早期穩(wěn)定性起到了至關(guān)重要的作用[8]。SRSF1被認(rèn)為是一種原癌蛋白，在既往研究中被證明在乳腺腫瘤中的表達(dá)水平上調(diào)，并通過調(diào)節(jié)選擇性剪接促進(jìn)乳腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[9]。此外，其在肺腫瘤、結(jié)腸腫瘤、小腸腫瘤、腎腫瘤、甲狀腺腫瘤、肝腫瘤、胰腺腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及急性淋巴細(xì)胞白血病中存在過表達(dá)現(xiàn)象[10～15]。

Caspase（cysteinyl aspartate specific proteinase）家族，即半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶家族，是細(xì)胞凋亡過程中重要的凋亡促進(jìn)因子。當(dāng)Caspase蛋白活性受抑制可誘發(fā)細(xì)胞凋亡障礙，即細(xì)胞與增殖間動態(tài)平衡失調(diào)，可能促進(jìn)多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展。而Caspase-3是Caspase家族中的最重要凋亡者之一，可以通過細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外途徑促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[16]，是凋亡過程中的主要效應(yīng)因子，同時其是引起細(xì)胞凋亡的最下游成分。它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[17]。

現(xiàn)有學(xué)者研究證實SRSF1與細(xì)胞凋亡因子之間存在作用關(guān)系[18]，其可以通過調(diào)控Bcl-X和caspase激活的DNA酶抑制蛋白（inhibitor of caspase activated DNase，ICAD）的剪接影響腫瘤細(xì)胞的生長與凋亡[19]。在人非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中，SRSF1 可以增加抗凋亡蛋白survivin mRNA的穩(wěn)定性，提高其翻譯活性和表達(dá)，通過抑制促凋亡的caspse蛋白抑制肺癌細(xì)胞的凋亡[20]。同時本研究結(jié)果顯示 SRSF1及caspase-3在口腔鱗癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.249，P＝0.039，P＜0.05），表明 SRSF1 可能通過某種通路抑制了caspase-3蛋白的表達(dá)，提示二者關(guān)系密切，共同調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞的凋亡，并在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，SRSF1在口腔鱗癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)程度與病理分級以及腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。Caspase-3蛋白與SRSF1的表達(dá)程度呈負(fù)相關(guān)。提示SRSF1可以作為新的腫瘤標(biāo)志物，與caspase-3聯(lián)合用作口腔鱗癌的診斷、治療以及預(yù)后狀況的判斷。