邢夢(mèng)瑤， 馬小娟， 鞏雪俐， 買(mǎi)買(mǎi)提祖農(nóng)·買(mǎi)蘇爾， 于文燕， 張雪梅， 孫 湛

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830011)

心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰; heart failure，HF)是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，是各種嚴(yán)重心臟病的嚴(yán)重階段[1]，有著極高的死亡率，是當(dāng)今最為重要的心血管病之一。 因此，尋求新的干預(yù)措施以改善心衰患者的預(yù)后及生存率是醫(yī)學(xué)界亟待解決的問(wèn)題。眾多研究表明NF-κB信號(hào)通路參與了心衰、冠心病和高血壓等多類(lèi)心血管疾病的病理生理過(guò)程。不少研究人員認(rèn)為NF-κB中p65的激活很有可能是心血管炎性等疾病的共同發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)，通常涉及到造成心臟損傷的不利影響[2]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)p65后可提高心肌細(xì)胞抗氧化的能力[3]，抑制p65蛋白的表達(dá)可抑制NF-κB通路的激活。我們需尋找一種能有效抑制NF-κB通路中p65蛋白表達(dá)的方法來(lái)減輕心力衰竭等心血管疾病的病情。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠心室肌細(xì)胞H9c2由上海中科院細(xì)胞庫(kù)提供。rAAV9-eGFP-p65-siRNA(本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)構(gòu)建，Virovek生產(chǎn))。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS; Gibco)；DMEM高糖培養(yǎng)液(HyClone)；細(xì)胞質(zhì)蛋白/核蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白定量分析試劑盒(Sigma)；Western blot試劑盒(Cell Signaling Technology)；凋亡試劑盒(BD Pharmingen)。Heracell二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)；DM4000B型倒置熒光顯微鏡(LEICA)；EPICS ALTRA流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)。Quantity One分析軟件(Bio-Rad)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞用含有雙抗及10% FBS的 DMEM 高糖培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。待細(xì)胞長(zhǎng)到密度大概為培養(yǎng)瓶的80%～90%后用0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行傳代，每次傳代時(shí)細(xì)胞密度控制在1×108/L。傳3～5代。

2.2細(xì)胞分組 將H9c2細(xì)胞分為：(1)正常對(duì)照(blank control)組； (2)Ang II刺激(Ang II)組； (3)rAAV9-eGFP-p65-siRNA組；(4)rAAV9-eGFP+Ang II組；(5)rAAV9-eGFP組；(6)rAAV9-eGFP-p65-siRNA+Ang II組。

2.3病毒轉(zhuǎn)染 將處理好的第2代或第3代融合約80%～90%的 H9c2細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)， 分別接種于25 mm2培養(yǎng)瓶中，濃度約為1×105。加入含有10% FBS的 DMEM進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，幾乎所有細(xì)胞貼壁后取出培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，按不同的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)把細(xì)胞分為5組：MOI=0 vg/cell的細(xì)胞組(對(duì)照組)，即未轉(zhuǎn)染病毒組； MOI=1×106vg/cell的細(xì)胞組； MOI=2×106vg/cell的細(xì)胞組； MOI=4×106vg/cell的細(xì)胞組； MOI=5×106vg/cell的細(xì)胞組。按 MOI不同分別加入不同滴度的用 DMEM培養(yǎng)液稀釋的 rAAV9-eGFP-p65-siRNA或 rAAV9-eGFP病毒液約1 mL，每組細(xì)胞做3個(gè)復(fù)樣。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，每30 min十字晃動(dòng)幾下，3～4 h后，在原有液體的基礎(chǔ)上繼續(xù)加入適量 FBS及DMEM， 使 FBS終濃度達(dá)到10%。培養(yǎng)24 h后起，應(yīng)用熒光倒置顯微鏡觀察，MOI=0 vg/cell作為對(duì)照組，于轉(zhuǎn)染后第1、2、3、4、5、6和7 d進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)的觀察，以波長(zhǎng)為490 nm的藍(lán)色光激發(fā)出綠色熒光的 H9c2細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，按一個(gè)隨機(jī)高倍視野下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)計(jì)算出平均百分率(重復(fù)6次)，并照相記錄。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 在eGFP表達(dá)高峰時(shí)間分別收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中H9c2細(xì)胞，離心，PBS洗滌2次后充分吹散細(xì)胞，200目濾網(wǎng)濾過(guò)，無(wú)需加抗體，直接用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP對(duì)H9c2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5CCK-8檢測(cè)病毒對(duì)細(xì)胞活力影響 向96孔板中加入100 μL的H9c2細(xì)胞懸液，密度大約為5×106/L，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h(37 ℃、5% CO2)，分別加入rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP進(jìn)行處理，120 h后每孔加入10 μL的CCK-8，孵育2～3 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A(450 nm)值，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中H9c2細(xì)胞，離心，PBS洗滌2次后加入400 μL PBS充分吹散細(xì)胞，200目濾網(wǎng)濾過(guò)，加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD)，室溫下避光孵育15 min，直接上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組重復(fù)3次。

2.7Western blot檢測(cè)蛋白水平 每條電泳道取 30 μg 提取的細(xì)胞總蛋白，以SDS-PAGE分離，然后再將蛋白通過(guò)電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，之后用1% TBST洗膜，再用 10%封閉液將其封閉，加入 抗NF-κB 抗體(p65 抗體)，在4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，次日，洗膜后加入適量的 II 抗工作液，顯色。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)、拍照，計(jì)算目的蛋白的積分光密度值，并與內(nèi)參照GAPDH比較，計(jì)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖像上的每個(gè)條帶重復(fù)測(cè)量 3 次，結(jié)果以積分吸光度值表示并記錄。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0及GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后大鼠心肌細(xì)胞H9c2中eGFP表達(dá)情況及細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的觀察

rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞后，在倒置熒光顯微鏡490 nm藍(lán)光激發(fā)下呈綠色。轉(zhuǎn)染后48 h，細(xì)胞中eGFP開(kāi)始表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度隨時(shí)間的推移而增強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后120 h達(dá)到高峰，之后開(kāi)始逐漸減弱。整個(gè)觀察周期過(guò)程中細(xì)胞狀態(tài)良好，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of eGFP in H9c2 cells (120 h after transfection; ×200; MOI=4×106 vg/cell).

2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染后分別收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞120 h的轉(zhuǎn)染率最高，分別為(53.4±1.8)%和(52.7±1.9)%，見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組結(jié)果比較，各時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP的細(xì)胞生長(zhǎng)情況相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說(shuō)明轉(zhuǎn)染rAAV9-eGFP-p65-siRNA 和rAAV9-eGFP均對(duì)H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)明顯影響，無(wú)明顯細(xì)胞毒性，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The viability of H9c2 cells measured by CCK-8 assay. Mean±SD. n=6.

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Ang II組和rAAV9-eGFP+Ang II組的細(xì)胞凋亡率分別為(20.3±1.4)%和(18.3±1.9)%，和對(duì)照組相比凋亡率明顯上升(P<0.05)；而rAAV9-eGFP-p65-siRNA和rAAV9-eGFP-p65-siRNA+Ang II組的凋亡率明顯下降，且和其它4組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

5 Western blot 檢測(cè)p65表達(dá)情況

正常對(duì)照組中，p65有一定的表達(dá)，當(dāng)給予rAAV9-eGFP-p65-siRNA的干擾時(shí)，p65表達(dá)降低(P<0.05)。當(dāng)給予Ang II刺激時(shí)，p65的表達(dá)較對(duì)照組增加(P<0.05)，但給予rAAV9-eGFP-p65-siRNA干擾后再給予Ang II刺激時(shí)，p65的表達(dá)不但不會(huì)增加，反而會(huì)降低。而rAAV9-eGFP對(duì)p65的表達(dá)無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Western blot for determining the protein expression of p65 in the H9c2 cells. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs blank control group.

討 論

心力衰竭是心臟癥候群的終末期表現(xiàn)，其心臟不能為身體提供足夠的血液供應(yīng)，通常是由于左心室功能障礙，是最終導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的最主要原因之一[4]。越來(lái)越多的證據(jù)表明[1]，NF-κB信號(hào)通路的激活與心力衰竭等多種心血管疾病有著密切的聯(lián)系。而NF-κB是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的關(guān)鍵因子，目前為止，已發(fā)現(xiàn)至少 5 個(gè)NF-κB家族成員，即c-Rel、p50、p52、p65 和RelB。細(xì)胞中發(fā)揮主要生理作用的是p65。NF-κB的過(guò)度活化可以引起多種疾病，若是能對(duì)其進(jìn)行有效的拮抗，便可對(duì)心血管炎癥反應(yīng)、惡性腫瘤等多種相關(guān)疾病的治療帶來(lái)突破性進(jìn)展[5]。因此調(diào)節(jié)和控制NF-κB通路中 p65的活性是一個(gè)理想的治療靶向，將通過(guò)多重環(huán)節(jié)起效，達(dá)到治療NF-κB相關(guān)疾病的目的。已有研究證實(shí)重組9型腺相關(guān)病毒載體(rAAV9-eGFP)對(duì)心肌有極強(qiáng)的靶向親和力[6-7]，可長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)外源基因[8]。心力衰竭是一個(gè)慢性的過(guò)程，所以rAAV9-eGFP成為目前心臟疾病基因治療的最佳載體。

高效特異性的 RNAi 技術(shù)目前已被廣泛的應(yīng)用于許多領(lǐng)域，比如基因功能研究、抗病毒感染和抗腫瘤等，具有高度特異性，高效性，快速性，長(zhǎng)度、濃度依賴性及高穩(wěn)定性等優(yōu)勢(shì)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將重組腺相關(guān)病毒 rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌H9c2細(xì)胞后，靶向抑制 NF-κB 通路活性，在細(xì)胞水平研究靶向抑制 NF-κB 信號(hào)通路中p65的活性對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用及細(xì)胞學(xué)機(jī)制，為防治心力衰竭發(fā)生提出新方案。

此實(shí)驗(yàn)證實(shí)rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，第2天開(kāi)始熒光表達(dá)，第5天達(dá)到高峰，并且Western blot結(jié)果顯示p65蛋白表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的siRNA技術(shù)能有效地抑制大鼠心肌H9c2細(xì)胞NF-κB通路中 p65的表達(dá)。

Ang II刺激心肌細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，這些因子以旁分泌或自分泌的方式調(diào)控心肌細(xì)胞自身和周?chē)男募〖?xì)胞代謝結(jié)構(gòu)功能而參與心肌重構(gòu)。另?yè)?jù)研究表明，NF-κB與血管緊張素II也存在密切的相關(guān)性[9]，可共同激活多種核轉(zhuǎn)錄因子。資料顯示，Ang II在刺激24 h、10-6mol/L 的濃度下時(shí)對(duì)細(xì)胞的刺激作用最強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)用此時(shí)間和濃度下的Ang II作為刺激因子[10]。

細(xì)胞給予Ang II刺激，細(xì)胞p65的表達(dá)量較空白對(duì)照組增高。在給予rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA轉(zhuǎn)染的前提下，再使用Ang II刺激，p65蛋白表達(dá)量未見(jiàn)明顯升高，進(jìn)一步說(shuō)明腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能有效沉默p65。p65表達(dá)的有效沉默是本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是其自身進(jìn)行的一種程序性的死亡方式。 在心肌梗死、缺血再灌注損傷等可發(fā)展為心力衰竭的多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都伴有心肌細(xì)胞的凋亡[11]。在各種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后中發(fā)揮著重要的作用[12]。有研究表明[13]，Ang II刺激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)NF-κB也是參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[14]，其在炎癥、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生和防止細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵的作用[15-17]，因?yàn)樗せ钤S多基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與細(xì)胞凋亡[18]。NF-κB通路被激活后向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，p65表達(dá)量增加，抗凋亡作用減弱，同時(shí)激活各種炎性因子的產(chǎn)生，而這些炎性因子又不斷刺激NF-κB的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加[19]。因此下調(diào)NF-κB通路的活性，可減輕心肌細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)重組腺相關(guān)病毒 rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌H9c2細(xì)胞后，p65表達(dá)降低，細(xì)胞的凋亡減少，可有效減少因細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞數(shù)量減少。

綜上所述，本研究利用RNA干擾技術(shù)，重組9型腺相關(guān)病毒作為載體可以成功、高效地沉默心肌細(xì)胞中的p65表達(dá)，并且證實(shí)利用rAAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA轉(zhuǎn)染大鼠心肌H9c2細(xì)胞可以明顯地降低細(xì)胞凋亡率，這為后期心力衰竭等心血管疾病的相關(guān)防治研究提供了有力的條件。