朱晨曦， 李文洲， 郭永連， 陳 琳， 彭 松， 衛(wèi) 丹

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院泌尿外科， 湖北 武漢 430014)

枸櫞酸為人類尿中含量豐富的結(jié)石抑制物，主要在腎近端小管被鈉離子依賴性二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Na+/dicarboxylate cotransporter 1，NaDC1)介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)重吸收[1]。NaDC1是一種酶調(diào)控參與的二羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白，其表達(dá)上調(diào)時(shí)，枸櫞酸的轉(zhuǎn)運(yùn)重吸收會(huì)增多，引起終尿里枸櫞酸含量下降，最終導(dǎo)致低枸櫞酸尿癥[2]。因此探究NaDC1對(duì)低枸櫞酸尿癥發(fā)病的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)為細(xì)胞質(zhì)激酶之一，維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)是一種配體依賴性核轉(zhuǎn)錄因子，兩者均在細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝及增殖分化等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，PKC和VDR分別與二羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的酶調(diào)控與蛋白表達(dá)相關(guān)[3]。同時(shí)有研究證實(shí)，PKC與VDR表達(dá)調(diào)控間存在相互作用[4-5]，但其相互作用對(duì)NaDC1表達(dá)的影響卻鮮有報(bào)道。

本研究分別采用PKC激動(dòng)劑(agonist)、PKC抑制劑(inhibitor)、VDR過表達(dá)載體及VDR-shRNA載體干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRE-52E，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PKC、VDR和NaDC1的蛋白表達(dá)，并分析PKC、VDR及其相互作用對(duì)NaDC1蛋白表達(dá)的影響，為低枸櫞酸尿癥的臨床治療提供理論參考。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco；PKC激動(dòng)劑佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)和PKC抑制劑G?6983購(gòu)自Sigma；VDR過表達(dá)載體質(zhì)粒、VDR-shRNA載體質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司； 抗PKC抗體、抗VDR抗體、抗NaDC1抗體和抗GAPDH抗體購(gòu)自Abcam；RIPA裂解液、DAB試劑盒和Lipo6000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自碧云天。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 解凍復(fù)蘇大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每3～5 d 繼代1次。

2.2Western blot實(shí)驗(yàn) 6孔板上每孔接種2 mL(2×105個(gè))處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞，24 h 后棄去舊培養(yǎng)液，分為對(duì)照(control)組、PKC agonist組和PKC inhibitor組。Control組每孔加2 mL新鮮培養(yǎng)液，PKC agonist組每孔加2 mL含PKC激動(dòng)劑PMA(終濃度為10 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液，PKC inhibitor組每孔加2 mL含PKC抑制劑G?6983(終濃度為10 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞。用RIPA緩沖液提取總蛋白，SDS-PAGE后，以抗PKC(1∶800)、VDR(1∶800)、NaDC1(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)抗體為 I 抗，4 ℃孵育過夜；洗膜，室溫孵育II抗(1∶10 000)1 h，DAB顯色，采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀曝光條帶，F(xiàn)luor Chem軟件讀取條帶吸光度，以GAPDH為內(nèi)參照做相對(duì)定量分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) VDR過表達(dá)載體質(zhì)粒、VDR-shRNA載體質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒均由武漢華聯(lián)科生物科技有限公司構(gòu)建并鑒定。NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染按Lipo6000產(chǎn)品說明書操作，陽性克隆篩選方法參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。連續(xù)培養(yǎng)篩選后的細(xì)胞，確定空載體、VDR穩(wěn)定過表達(dá)和VDR穩(wěn)定干擾的NRK-52E細(xì)胞株，分別于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期取上述3種細(xì)胞株各1瓶，6孔板上分為control組、VDR overexpression組和VDR interference組，分別接種2 mL (2×105個(gè))空載體、VDR穩(wěn)定過表達(dá)和VDR穩(wěn)定干擾的NRK-52E細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中VDR蛋白表達(dá)(后續(xù)Western blot操作同2.2)。

2.4PKC激動(dòng)劑/抑制劑聯(lián)合VDR異常表達(dá)處理實(shí)驗(yàn) 分別于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期取上述3種細(xì)胞株各1瓶，6孔板上分為control組、VDR interference組、VDR interference+PKC agonist組、VDR over-expression組、VDR over-expression+PKC inhibitor組。 Control組每孔接種2 mL (2×105個(gè))空載體NRK-52E細(xì)胞；VDR interference組、VDR interference+PKC agonist組每孔接種2 mL (2×105個(gè))VDR穩(wěn)定干擾的NRK-52E細(xì)胞；VDR over-expression組、VDR over-expression+PKC inhibitor組每孔接種2 mL (2×105個(gè))VDR穩(wěn)定過表達(dá)的NRK-52E細(xì)胞。培養(yǎng)24 h 后棄去舊培養(yǎng)液，control組、VDR interference組和VDR over-expression組每孔加2 mL新鮮培養(yǎng)液，VDR interference+PKC agonist組每孔加2 mL含PKC激動(dòng)劑PMA(終濃度為10 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液，VDR over-expression+PKC inhibitor組每孔加2 mL含PKC抑制劑G?6983(終濃度為10 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞中PKC和NaDC1的蛋白表達(dá)(后續(xù)Western blot操作同2.2)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PKC活性對(duì)PKC、VDR和NaDC1蛋白表達(dá)的影響

與control組比較，PKC agonist組PKC表達(dá)量顯著上調(diào)，PKC inhibitor組PKC表達(dá)量顯著下降(P<0.05),表明PKC激動(dòng)劑和PKC抑制劑分別促進(jìn)和降低PKC蛋白表達(dá)。PKC agonist組VDR和NaDC1表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，而PKC inhibitor組VDR表達(dá)量與control組相比差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，NaDC1的表達(dá)量顯著下降(P<0.05),表明PKC活性增強(qiáng)時(shí)VDR和NaDC1的表達(dá)顯著上調(diào)，PKC活性降低時(shí)對(duì)VDR的表達(dá)無影響，而NaDC1的表達(dá)顯著下調(diào)，見圖1。

Figure 1. The effects of PKC activity on the protein expression of PKC, VDR and NaDC1. Mean±SD. n=3. * P<0.05, ** P<0.01 vs control group.

2 VDR穩(wěn)定過表達(dá)與穩(wěn)定干擾NRK-52E細(xì)胞株的鑒定結(jié)果

VDR over-expression組和VDR interference組的VDR蛋白表達(dá)量分別較control組和空載體細(xì)胞組上調(diào)和下降(P<0.05),表明本研究成功建立穩(wěn)定過表達(dá)VDR和 穩(wěn)定敲減VDR表達(dá)的NRK-52E細(xì)胞株，效果良好，見圖2。

3 PKC活性變化和VDR異常表達(dá)對(duì)PKC和NaDC1蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步研究大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E中PKC、VDR及其相互作用對(duì)NaDC1表達(dá)的影響，本實(shí)驗(yàn)分別給予PKC激活劑和PKC抑制劑處理VDR干擾表達(dá)及VDR過表達(dá)的NRK-52E細(xì)胞6 h，再檢測(cè)干預(yù)前后PKC和NaDC1的蛋白表達(dá)情況。與control組比較，VDR interference組的PKC和NaDC1表達(dá)量均顯著下降(P<0.05); VDR over-expression組的PKC和NaDC1表達(dá)量均顯著上升(P<0.05),表明VDR過表達(dá)時(shí)PKC和NaDC1的表達(dá)顯著上調(diào)，VDR表達(dá)減少時(shí)PKC和NaDC1的表達(dá)顯著下降。給予PKC激活劑和PKC抑制劑分別干預(yù)VDR干擾表達(dá)及VDR過表達(dá)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞后，VDR interference+PKC agonist組和VDR over-expression+PKC inhibitor組的PKC和NaDC1蛋白表達(dá)水平的差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，且均顯著高于control組和VDR interference組的表達(dá)量，并均顯著低于VDR over-expression組的表達(dá)量，見圖3。

Figure 2.The protein expression of VDR in different NRK-52E cell lines. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group.

討 論

本研究首先采用PKC激動(dòng)劑和PKC抑制劑分別處理正常大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E，結(jié)果表明PKC活性增強(qiáng)時(shí)VDR和NaDC1表達(dá)顯著上調(diào)，PKC活性降低時(shí)對(duì)VDR表達(dá)無影響，而NaDC1表達(dá)下調(diào)。前期研究發(fā)現(xiàn)，在人腎近曲小管上皮細(xì)胞HK2中VDR與NaDC1間存在明顯正相關(guān)，它通過調(diào)節(jié)NaDC1的活性參與了尿枸櫞酸的調(diào)控[7]。在大鼠、小鼠及人體中PKC可以具有種屬及組織特異性地在mRNA及蛋白水平上調(diào)控VDR的表達(dá)[8]。PKC激活劑可以誘導(dǎo)大鼠肝臟中VDR的表達(dá)，并且該誘導(dǎo)作用可被PKC抑制劑抑制[9]。因此，我們推斷PKC信號(hào)通路和VDR功能之間存在關(guān)聯(lián)，PKC激動(dòng)劑通過增強(qiáng)PKC活性誘導(dǎo)VDR高表達(dá)，VDR高表達(dá)時(shí)NaDC1的表達(dá)亦增高。本研究還顯示，PKC抑制劑降低PKC活性引起NaDC1表達(dá)下調(diào)，而對(duì)VDR表達(dá)無影響。國(guó)內(nèi)外研究者也有類似的發(fā)現(xiàn)，Reinhardt等[10]采用PKC激動(dòng)劑和PKC抑制劑分別處理大鼠成骨肉瘤細(xì)胞，表明PKC激動(dòng)劑可以在2～4 h和6～20 h間持續(xù)增強(qiáng)VDR表達(dá)，而PKC抑制劑對(duì)VDR表達(dá)無影響。張萍等[3]指出PKC抑制劑能顯著阻止高糖導(dǎo)致的人近端腎小管上皮細(xì)胞HKC過度表達(dá)hNaDC3。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在爪蟾卵母細(xì)胞中PKC信號(hào)通路參與NaDC1活性的快調(diào)節(jié)，PKC激活劑通過劑量依賴性增強(qiáng)移除細(xì)胞膜上載體蛋白的胞吞作用，聯(lián)合對(duì)NaDC1載體本身活性的削弱作用共同抑制NaDC1的功能，并且這種抑制作用并不依賴PKC對(duì)NaDC1的磷酸化[11]。關(guān)于PKC激動(dòng)劑促進(jìn)NaDC1表達(dá)的研究目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少，通過本實(shí)驗(yàn)我們也無法完全確定PKC激動(dòng)劑與NaDC1表達(dá)間的調(diào)控關(guān)系。究其原因可能是PKC對(duì)特定生物反應(yīng)的功能影響因素復(fù)雜，與細(xì)胞的類型、生長(zhǎng)狀態(tài)、分化階段和外界刺激等諸多調(diào)節(jié)因素有關(guān)，其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

Figure 3. PKC activity and VDR abnormal expression on protein expression of PKC and NaDC1. Mean±SD. n=3. *P<0.05, ** P<0.01 vs control group; # P<0.05 vs VDR interference group; △ P<0.05 vs VDR over-expression group; ※ P<0.05 vs VDR interference+PKC agonist group.

本實(shí)驗(yàn)接下來在成功建立VDR穩(wěn)定過表達(dá)和VDR穩(wěn)定干擾的NRK-52E細(xì)胞株基礎(chǔ)上，進(jìn)行VDR過表達(dá)及VDR干擾的NRK-52E細(xì)胞中PKC和NaDC1蛋白表達(dá)情況的研究。由結(jié)果可以看出，與control組比較，VDR活性增強(qiáng)時(shí)PKC和NaDC1表達(dá)顯著上調(diào)，VDR活性降低時(shí)PKC和NaDC1表達(dá)顯著下降。在VDR對(duì)PKC表達(dá)調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)，VDR含量增加可以增進(jìn)PKC活性，而抑制VDR表達(dá)則抑制PKC活性[12]。因此我們推斷VDR高表達(dá)時(shí)可促進(jìn)PKC和NaDC1表達(dá)；VDR低表達(dá)時(shí)則抑制PKC和NaDC1表達(dá)，同時(shí)受抑制的PKC會(huì)進(jìn)一步降低NaDC1的表達(dá)水平。本研究給予PKC激動(dòng)劑PMA和PKC抑制劑G?6983分別干預(yù)VDR干擾表達(dá)及VDR過表達(dá)的NRK-52E細(xì)胞。結(jié)合前面的分析，VDR interference+PKC agonist組中PKC激動(dòng)劑增強(qiáng)PKC活性從而誘導(dǎo)干擾組的VDR增量表達(dá)，VDR的增量表達(dá)又會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)PKC活性和NaDC1表達(dá)，PKC激動(dòng)劑和VDR的增量表達(dá)對(duì)PKC和NaDC1蛋白表達(dá)的正向積累已高于control組，完全消除了VDR干擾處理帶來的影響，但均低于VDR over-expression組的蛋白表達(dá)量；而VDR over-expression+PKC inhibitor組中PKC抑制劑降低PKC活性會(huì)減少部分NaDC1表達(dá)，但由于PKC活性降低并不影響VDR表達(dá)，VDR高表達(dá)對(duì)PKC及NaDC1有促進(jìn)作用，所以盡管VDR over-expression+PKC inhibitor組中PKC和NaDC1表達(dá)與VDR over-expression組存在差異,但依然高于control組并遠(yuǎn)高于VDR interfe-rence組，因此PKC抑制劑并未完全消除VDR過表達(dá)處理帶來的影響。由上可知，PKC激動(dòng)劑與VDR過表達(dá)對(duì)促進(jìn)或維持NRK-52E細(xì)胞中NaDC1表達(dá)量發(fā)揮重要作用。同時(shí)，VDR interference+PKC agonist組和VDR over-expression+PKC inhibitor組的PKC和NaDC1表達(dá)水平間的差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，VDR與PKC間相互作用及因此對(duì)NaDC1表達(dá)產(chǎn)生影響的復(fù)雜性可見一斑。

綜上所述，在大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E中PKC活性增強(qiáng)誘導(dǎo)VDR表達(dá)， PKC活性減弱抑制NaDC1表達(dá)；VDR與PKC和 NaDC1的表達(dá)存在明顯正相關(guān)；PKC與VDR間相互作用對(duì)NaDC1表達(dá)的影響中，PKC高活性和VDR過表達(dá)為促進(jìn)或維持NaDC1蛋白表達(dá)的主要因素。