溫藝超， 陳偉燕， 謝富華， 陳潔茹

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 廣東 廣州 510260)

缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)是由于腦部血液供應(yīng)障礙、缺血以及缺氧導(dǎo)致的腦組織缺血性壞死或者腦軟化[1]。腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且具有嚴(yán)重危害性，一旦發(fā)生尚無特效的治療方式，為全球第二大致殘致死疾病，故如何有效防治腦卒中是當(dāng)前醫(yī)學(xué)專家致力研究的重點領(lǐng)域[2-3]。流行病學(xué)以及動物實驗研究等成果顯示，性別、年齡、心臟病、糖尿病、高血壓、吸煙以及高脂血癥等均是CIS發(fā)生的危險因素[4]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是由不健康的生活方式如高脂飲食、運(yùn)動量少及生活壓力大等引起的機(jī)體脂代謝紊亂，從而誘導(dǎo)局部慢性炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷引起的[5]。已有研究證實AS是引發(fā)心血管疾病的重要危險因素之一[6]。腦動脈粥樣硬化導(dǎo)致血管腔狹窄、阻塞引起腦組織缺血、缺氧壞死。

Notch信號通路由Notch配體、Notch受體以及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子3個部分組成。已有研究證實腦組織缺血損傷后可通過激活Notch信號通路抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化，由此維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖來保護(hù)缺血組織[7]。γ-分泌酶通過組成型酶切能夠激活Notch通路相關(guān)基因的表達(dá)，因此γ-分泌酶抑制劑DAPT能夠抑制Notch信號通路信號的傳遞。研究發(fā)現(xiàn)DAPT阻斷Notch信號通路后，由缺血誘導(dǎo)的Notch1和Hes1表達(dá)以及細(xì)胞增殖顯著下降[8]。Notch信號通路相關(guān)分子在正常組織中呈低表達(dá)，而腦缺血后其表達(dá)可被激活，因此通過研究Notch信號通路與動脈粥樣硬化以及缺血性腦卒中的關(guān)系，可以增加對動脈粥樣硬化型缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制的了解[9]。本研究通過建立動脈粥樣硬化型缺血性腦卒中大鼠模型，探索Notch信號通路在動脈粥樣硬化型缺血性腦卒中的作用。本研究結(jié)果可為闡明缺血性腦卒中性血管疾病的理論基礎(chǔ)提供新思路，為臨床診斷治療提供新策略。

材 料 和 方 法

1 實驗動物與分組

SPF級成年雄性SD大鼠24只，體重(250±20) g，購自廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。采用數(shù)字隨機(jī)法隨機(jī)分為對照(control，6只)組和模型(18只)組，AS模型建立后隨機(jī)分為假手術(shù)(AS-sham)組、缺血處理(AS-ischemia)組和DAPT處理(AS-ischemia-DAPT)組，每組6只。

2 主要試劑

DAPT購自Tocris Bioscience；戊巴比妥鈉購自上海信裕生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自Bio-Swamp；RIPA裂解液購自上海碧云天公司；抗Notch1、Hes1、核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)抗體和羊抗兔IgG購自Abcam。

3 主要方法

3.1大鼠AS和AS-ischemia模型的建立 對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，AS模型組均給予高脂飼料(2%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉、8%全脂奶粉和69.5%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)，每天30～40 g，自由攝水，并定期觀察體重、飲水、外觀以及活動情況，飼養(yǎng)6周。從第7周開始對AS-ischemia-DAPT組進(jìn)行隔天皮下注射DAPT (5 mg/kg)，control組、AS-sham組和AS-ischemia組隔天皮下注射同等體積的生理鹽水，注射周期為6周。然后參考Mestl等[10]的方法制作雙側(cè)頸總動脈(2VO)結(jié)扎模型。AS建模結(jié)束后，缺血性腦卒中建模前實驗動物禁食8 h，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定并沿頸中線切開，分離出雙側(cè)頸總動脈；control和AS-sham組動物僅作雙側(cè)頸總動脈分離但不結(jié)扎，AS-ischemia和AS-ischemia-DAPT組動物采用尼龍線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈。造模6 h后心臟采血，取頸動脈組織固定于4%多聚甲醛用于組織病理觀察，取動脈組織和腦組織于EP管中保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

3.2HE染色檢測大鼠頸動脈結(jié)構(gòu)變化 將大鼠頸動脈組織從多聚甲醛中取出，使用梯度濃度乙醇脫水以及使用二甲苯透明，石蠟包埋、切片。將切片在二甲苯中脫蠟處理，經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入蘇木精染色，1%鹽酸乙醇分色20 s，流水沖洗后0.5%伊紅染液染色，乙醇脫水透明，封片，顯微鏡下觀察分析。

3.3Western blot檢測大鼠頸動脈組織中Notch1和Hes1以及腦組織中NF-κB和TLR4的蛋白表達(dá) 取組織50 mg于1.5 mL EP管中并加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液1 mL，每管加入2粒玻璃珠，勻漿器勻漿；4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肂CA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每組取30 μg動脈組織蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，檢測Notch1和Hes1蛋白表達(dá)情況；每組取30 μg腦組織蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，檢測NF-κB和TLR4蛋白表達(dá)情況；以GAPDH作為內(nèi)參照，使用BandScan 5.0軟件進(jìn)行圖像分析。

3.4血脂以及血清炎癥因子的檢測 采用全自動生化分析儀檢測大鼠血液甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清炎癥因子IL-6和TNF-α的水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組之間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 抑制Notch通路對大鼠頸動脈組織結(jié)構(gòu)的影響

對照組大鼠動脈血管壁光滑完整，無脂質(zhì)沉積、斑塊形成和血管狹窄現(xiàn)象出現(xiàn)。AS模型大鼠動脈血管較正常組呈現(xiàn)出內(nèi)膜層增厚、血管狹窄、形成粥樣硬化斑塊等明顯病理形態(tài)改變。DAPT抑制Notch信號通路以后能夠降低內(nèi)膜層增厚以及血管狹窄，明顯減輕動脈粥樣硬化的病變程度,見圖1。

2 DAPT顯著抑制大鼠頸動脈Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)

AS以及AS缺血性腦卒中大鼠頸動脈組織中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)顯著高于正常大鼠；但與AS缺血性腦卒中組相比，DAPT處理后大鼠頸動脈組織中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),見圖2。這一結(jié)果說明AS能夠激活Notch通路，但DAPT處理能夠顯著抑制AS誘導(dǎo)的Notch通路的激活。

Figure 2.The protein expression levels of Notch1 and Hes1 in the rat arterial tissues. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs AS-ischemia group.

3 抑制Notch對大鼠血脂水平的影響

與對照組相比，AS-sham組以及AS-ischemia組大鼠血液指標(biāo)TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平顯著升高(P<0.05)；與AS-ischemia組相比，使用DAPT抑制Notch信號通路以后大鼠TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 抑制Notch對大鼠血清炎癥因子的影響

與對照組相比，AS-sham組以及AS-ischemia組大鼠血清中促炎因子IL-6和TNF-α的水平顯著升高(P<0.05)，且AS-ischemia組大鼠血清中促炎因子IL-6的水平顯著高于AS-sham組(P<0.05)；與AS-ischemia組相比，使用DAPT抑制Notch信號通路以后大鼠血清中IL-6和TNF-α的水平顯著降低(P<0.05),見圖4。

Figure 3.The effects of blocking Notch pathway by DAPT on lipid levels of the rat. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs AS-ischemia group.

5 抑制Notch對大鼠腦組織中NF-κB和TLR4蛋白水平的影響

各組大鼠腦組織中NF-κB和TLR4的蛋白水平示,與對照組相比，AS-sham組和AS-ischemia組大鼠腦組織中NF-κB和TLR4的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，且AS-ischemia組大鼠腦組織中NF-κB和TLR4的蛋白表達(dá)水平顯著高于AS-sham組(P<0.05)；與動脈粥樣硬化腦缺血大鼠相比，經(jīng)過DAPT抑制Notch通路以后動脈粥樣硬化腦缺血大鼠腦組織中NF-κB和TLR4顯著降低(P<0.05),見圖5。

Figure 4.The rat serum levels of IL-6 and TNF-α. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs AS-sham group; ▲P<0.05 vs AS-ischemia group.

Figure 5.The protein expression levels of NF-κB and TLR4 in the rat brain tissues. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs AS-sham group; ▲P<0.05 vs AS-ischemia group.

討 論

頸動脈粥樣硬化被認(rèn)為是急性缺血性腦卒中的主要病因，急性腦梗死的危險因素和臨床預(yù)后與頸動脈血管狹窄程度呈明顯正相關(guān)[11]。動脈粥樣硬化能夠引起血管內(nèi)膜增厚、損傷形成斑塊，導(dǎo)致血管狹窄。動脈粥樣硬化斑塊脫落形成栓子、血管狹窄以及引起血液流變動力學(xué)改變是誘發(fā)腦缺血的主要機(jī)制[12]。已有研究證實AS發(fā)生的過程中LDL-C經(jīng)過氧化修飾形成氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成和促炎介質(zhì)的釋放、激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致AS斑塊纖維帽變薄，增加CIS的風(fēng)險[13]。高TG也是AS發(fā)生的危險因素之一，其可降低LDL-C的顆粒大小，誘發(fā)炎癥反應(yīng)以及增加血管內(nèi)膜的通透性，促進(jìn)AS的發(fā)生[14]。因此，全面控制血脂指標(biāo)，抑制血管內(nèi)膜炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定AS斑塊，是預(yù)防CIS的關(guān)鍵。

Notch通路由一類編碼高度保守的細(xì)胞表面受體基因組成，通過細(xì)胞間的信號傳遞作用參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡調(diào)控[15]。已有研究發(fā)現(xiàn)ox-LDL能夠顯著提高Notch1受體在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，證實Notch信號通路的表達(dá)與動脈粥樣硬化形成相關(guān)[16]。Notch信號通路的激活不僅可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化釋放促炎因子，還可以通過調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化參與炎癥反應(yīng)[17]。Notch通路中配體與受體結(jié)合后經(jīng)γ-分泌酶進(jìn)行組成型酶切激活相關(guān)基因的表達(dá)。γ-分泌酶抑制劑DAPT能夠抑制Notch信號通路傳遞。本研究通過使用DAPT抑制大鼠體內(nèi)Notch信號通路活性，探究其對動脈粥樣硬化缺血性腦卒中大鼠的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS模型大鼠動脈血管內(nèi)膜明顯增厚，TG、TC、HDL-C和LDL-C水平以及血清炎癥因子IL-6和TNF-α水平顯著升高，且AS缺血性腦卒中模型組IL-6和TNF-α水平顯著高于AS模型大鼠。但是使用DAPT抑制Notch信號通路活性以后大鼠動脈血管內(nèi)膜增厚得到改善，血清炎癥因子IL-6和TNF-α水平也顯著降低。本研究結(jié)果表明抑制Notch通路能夠通過抑制促炎因子的釋放顯著改善AS缺血性腦卒中的癥狀。

在缺血性腦損傷中，TLR4可以通過一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-6、IL-1和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，激活炎癥反應(yīng)。NF-κB位于TLR4下游信號通路的樞紐中心，參與細(xì)胞增殖、凋亡中的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，在動脈粥樣硬化形成以及缺血性腦卒中的腦損傷中發(fā)揮重要作用[18]。NF-κB激活后可以通過調(diào)節(jié)靶基因的活性參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和自由基損傷等過程。在動脈粥樣硬化缺血性腦卒中，NF-κB的激活是引起腦組織繼發(fā)性損傷的重要樞紐[19]。本研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化大鼠腦組織中NF-κB和TLR4的蛋白表達(dá)水平顯著高于正常大鼠，且動脈粥樣硬化缺血性腦卒中大鼠大腦組織中NF-κB的水平顯著高于動脈粥樣硬化大鼠；且使用DAPT抑制Notch信號通路以后動脈粥樣硬化缺血性腦卒中大鼠腦組織中的NF-κB和TLR4蛋白水平顯著降低。Notch通路對于NF-κB TLR4的作用可以表現(xiàn)為激活，也可以表現(xiàn)為抑制。肝星狀細(xì)胞中抑制Notch可以降低NF-κB的活性，但是在小鼠造血前體細(xì)胞中Notch可以促進(jìn)NF-κB通路中p60等的表達(dá)。在大鼠腎臟缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)DAPT抑制Notch通路可以通過降低NF-κB/TLR4的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[20-21]。但是Notch通路在動脈粥樣硬化缺血性腦卒中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制Notch通路可以通過降低動脈粥樣硬化缺血性腦卒大鼠腦組織中NF-κB/TLR4通路的活化，抑制大鼠腦組織中的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腦保護(hù)作用[22]。

綜上所述，本研究通過建立AS缺血性腦卒中大鼠模型，從血脂水平和炎癥反映兩個方面探究了Notch通路對AS缺血性腦卒中的影響。研究發(fā)現(xiàn)抑制Notch通路能夠顯著改善AS缺血性腦卒中大鼠的血脂水平以及降低其血清炎癥因子水平，達(dá)到改善AS的作用。不僅如此，抑制Notch還可以通過降低AS缺血性腦卒中大鼠腦組織中NF-κB/TLR4通路的表達(dá)抑制腦組織炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對動脈粥樣硬化缺血性腦卒中的保護(hù)作用。