張光耀， 莊正陵， 楊進(jìn)波

(1宜城市人民醫(yī)院骨科， 湖北 宜城 430071； 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院 2骨科， 3檢驗(yàn)科， 湖北 襄陽 441000)

骨肉瘤是一種常見的人類惡性骨腫瘤，多發(fā)于青少年，其發(fā)病率位于第3位，僅次于淋巴瘤和腦腫瘤，具有惡性程度高和易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[1-2]。目前常用的治療手段是輔助化療、手術(shù)切除轉(zhuǎn)移灶以及術(shù)后化療，但30%～40%轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者對化療的敏感性差，5年生存率較低，且易復(fù)發(fā)[3]。因此遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是影響骨肉瘤治療與預(yù)后的重要因素。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生甚至復(fù)發(fā)的重要因素之一。機(jī)體發(fā)生損傷和感染可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生惡變，引起DNA損傷，激活原癌基因或促進(jìn)抑癌基因異常表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[4-5]，提示炎癥因子以及炎癥反應(yīng)通路對骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A，SAA)是一種炎癥相關(guān)反應(yīng)蛋白，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染、腫瘤和創(chuàng)傷時(shí)，SAA的表達(dá)量顯著上調(diào)[6]。研究表明，SAA可作為一種腫瘤診斷和預(yù)防的非特異性標(biāo)記物，與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。因此，本研究通過小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)沉默SAA在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，探究SAA在骨肉瘤中的發(fā)生、發(fā)展中的作用以及可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM無血清培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco；二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)購自Sigma；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Costar；siRNA由Santa Cruz Biotechnology合成；細(xì)胞裂解液和細(xì)胞活力檢測試劑盒購自蘇州碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏公司；Lipofectamine 2000購自Life Tech；兔抗人SAA抗體和兔抗人β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購自Abcam；兔抗人磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinases，p-p38 MAPK)抗體購自Cell Signaling Technology；兔抗人磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)抗體和辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔或鼠IgG購自北京中杉金橋有限公司。-80 ℃冰箱購自中國海爾公司；移液器購自Eppendorf；電泳儀和轉(zhuǎn)膜槽購自Bio-Rad；CO2培養(yǎng)箱購自Heraeus。

2 方法

2.1細(xì)胞的培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度為95%左右，棄去培養(yǎng)基，加入0.25%胰酶-EDTA消化1 min，倒置顯微鏡中觀察到細(xì)胞完全脫落，加入15 mL完全培養(yǎng)基，吹打均勻，封裝在3個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞的干預(yù) 轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為80%左右，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白對照(control)組、陰性對照(negative control siRNA,NC-siRNA)組和實(shí)驗(yàn)組(SAA-siRNA)，其中陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組分別轉(zhuǎn)染NC-siRNA和SAA-siRNA，空白對照組不做任何處理。轉(zhuǎn)染時(shí)，將siRNA和Lipofectamine 2000與Opti-MEM不含血清培養(yǎng)基混合均勻，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot法檢測各組細(xì)胞中SAA的蛋白表達(dá)。

2.3細(xì)胞活力的檢測 轉(zhuǎn)染前24 h，將骨肉瘤細(xì)胞U2OS接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，每組4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，根據(jù)方法2.2轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入新鮮的20 μL MTT試劑，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔細(xì)胞加入200 μL DMSO，振蕩混勻10 min，采用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長下的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

2.4細(xì)胞凋亡情況的檢測 轉(zhuǎn)染前24 h，將骨肉瘤細(xì)胞U2OS接種于6孔培養(yǎng)板上，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，加入緩沖液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×109/L，吸取100 μL細(xì)胞重懸液加入5 mL離心管中，加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混勻，25 ℃避光反應(yīng)15 min，加入400 μL緩沖液，1 h內(nèi)上機(jī)測定細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5細(xì)胞侵襲和遷移能力的檢測 侵襲實(shí)驗(yàn)中將Matrigel置于4 ℃過夜融化，與無血清培養(yǎng)基按1 ∶3的比例充分混勻，取25 μL加入Transwell小室上室中，37 ℃通風(fēng)30 min，使Matrigel充分聚合成膠。磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)清洗各組細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×108/L，吸取100 μL細(xì)胞懸浮液加入Transwell小室上室中，同時(shí)加入200 μL無血清培養(yǎng)基。Transwell小室下室中500 μL含血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，濕棉簽輕輕拭去上室膜的細(xì)胞和凝膠，預(yù)冷的4%甲醛固定30 min，蘇木素染色1 min，梯度乙醇脫水，隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。遷移實(shí)驗(yàn)中Transwell小室上室膜不加入Matrigel，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

2.6Western blot檢測細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的水平 收集含有各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5min，棄去上清，加入1 mL 含PMSF的RIPA裂解混合液，置于冰上反應(yīng)20～30 min，4 ℃離心10 min，上清即為所提取蛋白質(zhì)。100 ℃煮10 min使蛋白質(zhì)變性。清洗玻璃板，按比例配置10%的分離膠和5%濃縮膠，插入梳子。將凝膠與玻璃板置于電泳槽中，拔出梳子，加入電泳液至玻璃板上沿，取適量蛋白樣品加入上樣孔，90 V電壓電泳至Marker條帶分離，電壓調(diào)整為120 V，待溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部，停止電泳。切除多余的凝膠，組裝轉(zhuǎn)膜裝置，調(diào)整電流至200 mA，置于冰上反應(yīng)90 min。將條帶放入5%封閉液中，常溫封閉1～2 h；置于搖床上Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween(TBST)洗滌3次，每次5 min，加入適量 I 抗稀釋液，4 ℃過夜。搖床上TBST洗滌3次，每次5 min,加入適量 II 抗稀釋液，搖床上振蕩2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，加入發(fā)光劑A、B液發(fā)光，成像儀中拍照，分析蛋白的相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)全部數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 檢測SAA蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)量

采用Western blot檢測SAA蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，SAA-siRNA能在蛋白水平上顯著下調(diào)SAA水平，與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

2 特異性下調(diào)SAA表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞活力的影響

采用MTT法檢測siRNA靶向下調(diào)SAA表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，特異性下調(diào)SAA表達(dá)降低骨肉瘤細(xì)胞的活力，與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，陰性對照組與空白對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 1.The protein expression of SAA in the osteosarcoma cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

Figure 2.The effect of down-regulation of SAA expression on the viability of osteosarcoma cells. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group.

3 特異性下調(diào)SAA表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測siRNA靶向下調(diào)SAA表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，特異性下調(diào)SAA表達(dá)增加骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率，與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，陰性對照組與空白對照組間的差異無無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

4 特異性下調(diào)SAA表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞侵襲能力的影響

通過Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測siRNA靶向下調(diào)SAA表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)果顯示，特異性下調(diào)SAA表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力，與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，陰性對照組與空白對照組間細(xì)胞的侵襲能力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

Figure 3.The effect of down-regulation of SAA expression on the apoptosis of osteosarcoma cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

Figure 4. The effect of down-regulation of SAA expression on invasion of osteosarcoma cells (scale bar=20 μm). Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group.

5 特異性下調(diào)SAA表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞遷移的影響

通過Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測siRNA靶向下調(diào)SAA表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示，特異性下調(diào)SAA表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力，與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖5。

Figure 5. The effect of down-regulation of SAA expression on migration of osteosarcoma cells (scale bar=20 μm). Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group.

6 特異性下調(diào)SAA表達(dá)對MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測骨肉瘤細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量，結(jié)果顯示，特異性下調(diào)SAA表達(dá)可抑制p-JNK和p-p38蛋白的水平，與空白對照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但總JNK和p38蛋白的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；陰性對照組與空白對照組細(xì)胞的p-JNK和p-p38蛋白水平量的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖6。

討 論

SAA是一種敏感的炎癥反應(yīng)蛋白，直接參與炎癥反應(yīng)過程。既往研究表明，在機(jī)體異常狀態(tài)，SAA能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，并可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6 )[8-10]。SAA與中性粒細(xì)胞聯(lián)合作用促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，引起血管內(nèi)皮發(fā)生損傷和功能障礙。研究證實(shí)，SAA通過調(diào)控MAPK參與腎小球硬化以及腎小管間質(zhì)纖維化過程[11-12]。近年來的研究表明，SAA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[13-14]。SAA不僅在正常組織中表達(dá)，在腫瘤組織比如肺癌、前列腺癌、骨肉瘤和結(jié)直腸癌中的水平明顯升高，提示SAA可作為腫瘤非特異性標(biāo)記物以及預(yù)防、診斷的檢測因子[15-18]。SAA的表達(dá)水平受多種因素的調(diào)節(jié)，與各種細(xì)胞信號(hào)通路的激活與抑制密切相關(guān)[19]。在本研究中，通過siRNA技術(shù)特異性沉默SAA在骨肉瘤中的水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組骨肉瘤細(xì)胞中SAA蛋白的表達(dá)量明顯降低；MTT法檢測結(jié)果顯示細(xì)胞的活力受到抑制；Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果表明下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中SAA的水平促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Transwell法檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力發(fā)現(xiàn)，降低骨肉瘤細(xì)胞中SAA的水平可抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力，提示SAA參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程，且增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖以及轉(zhuǎn)移能力，但其具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。

機(jī)體在正常情況下，細(xì)胞的增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡中，一旦打破這種平衡，則誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生；細(xì)胞的侵襲和遷移能力與腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)[20-22]。細(xì)胞的增殖與凋亡、轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，直接受多種基因、細(xì)胞因子、信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控[23]。細(xì)胞外多數(shù)信號(hào)傳導(dǎo)途徑均參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移過程。MAPK信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與腫瘤的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移等過程[24-26]。p38 MAPK和JNK是MAPK家族中的重要成員之一，受外界多種信號(hào)因子的調(diào)控，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和遷移等過程[27-29]。研究表明，p38 MAPK和JNK活性的降低抑制了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力[30]。本研究的結(jié)果顯示，特異性下調(diào)SAA在骨肉瘤中的表達(dá)量可抑制p38和JNK磷酸化水平，對總JNK和p38蛋白的表達(dá)量無明顯影響，表明SAA能夠激活p38 MAPK和JNK信號(hào)通路，激活p38 MAPK和JNK信號(hào)通路可能是SAA促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞生長、凋亡和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制之一。

綜上所述，下調(diào)SAA的表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)其凋亡，降低細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，可能是通過p38 MAPK和JNK信號(hào)通路發(fā)揮其主要作用，提示下調(diào)SAA具有較好的誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和抑制其轉(zhuǎn)移能力的作用，SAA有可能成為治療骨肉瘤的新靶標(biāo)，在預(yù)防和治療骨肉瘤方面具有良好的應(yīng)用前景。