施 莉， 胡麗瑜， 鐘定福， 郭存果， 施小英

(金華市人民醫(yī)院消化科， 浙江 金華 321000)

胃癌發(fā)病率和死亡率均居我國(guó)惡性腫瘤前列，是威脅人類生命健康的主要疾病之一，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確[1]。因此，解析胃癌的發(fā)病機(jī)理、探索新的分子標(biāo)志物并挖掘有效的分子治療靶點(diǎn)已成為臨床胃癌診治的迫切需求。

近年來(lái)，非編碼RNA(non-coding RNA)，尤其是微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在腫瘤發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究中引起了廣泛關(guān)注[2-4]。miRNA是一類長(zhǎng)度為21～25個(gè)核糖核苷酸的非編碼內(nèi)源性小單鏈RNA 分子，通過(guò)與靶基因3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’UTR)互補(bǔ)結(jié)合，可靶向調(diào)控約50%的編碼基因翻譯。因此，miRNA參與多種細(xì)胞生理和病理過(guò)程，如細(xì)胞周期、凋亡和分化等[5-6]。miRNA在不同腫瘤組織中存在特異性表達(dá)模式，提示其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。盡管有研究報(bào)導(dǎo)若干miRNA在胃癌發(fā)生中扮演重要角色，但這些胃癌相關(guān)miRNA研究才剛剛開(kāi)始，更多具有調(diào)節(jié)功能并具備臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值的miRNA有待揭示。

本研究擬從發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者的腫瘤組織中尋找轉(zhuǎn)移相關(guān)候選miRNA，利用細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)明確候選miRNA是否具備促生長(zhǎng)、抑凋亡及促轉(zhuǎn)移能力。最后，構(gòu)建聯(lián)合靶向候選miRNA的載體模型，觀察其體內(nèi)抑癌作用，明確其臨床應(yīng)用價(jià)值。

材 料 和 方 法

1 臨床資料及標(biāo)本采集

臨床標(biāo)本選取腸外科手術(shù)后的胃癌患者，選取淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移患者各3例，年齡50～60歲，患者手術(shù)前均未接受抗腫瘤治療等處理。依據(jù)WHO胃癌病理學(xué)判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)胃癌組織學(xué)病理類型分類。每例患者留取相應(yīng)的腫瘤組織，組織離體10 min內(nèi)被置于液氮中凍存以待后續(xù)分析。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1總RNA的抽提 提取凍存的胃癌組織以及癌旁正常的胃黏膜組織標(biāo)本，并加入1 mL TRIzol，提取組織的總RNA，將之溶解于DEPC水中。用DNase進(jìn)一步處理RNA，為了明確RNA的濃度和純度，對(duì)RNA樣本A260/A280的檢測(cè)選用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)，比值在1.8～2.0之間則用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2候選miRNA的抑制和胃癌細(xì)胞活力的檢測(cè) 胃癌細(xì)胞BGC-823用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d視其生長(zhǎng)狀況傳代 1 次。取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的腫瘤細(xì)胞以每孔1×105接種96孔板，按照Lipofectmaine 2000說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行miR-29b、miR-92b及miR-106b的鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)修飾的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASO)轉(zhuǎn)染。處理48 h后，加入CCK-8溶液(每孔10 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量該樣品在450 nm處的吸光度(A)值。

2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 用胰酶消化BGC-823胃癌細(xì)胞株并用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。上室內(nèi)加入對(duì)照及處理細(xì)胞懸液，下室為600 μL含15% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。除去上室內(nèi)的液體，用棉棒擦拭出去上室底部表面覆蓋的細(xì)胞，將Transwell小室浸入固定液(50%甲醇液)固定15 min，PBS洗3遍。最后用結(jié)晶紫染色30 min，風(fēng)干后每孔隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)并計(jì)算其平均數(shù)。

2.4劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞遷移能力 用標(biāo)記筆劃?rùn)M線以進(jìn)行定位觀察，將胰酶消化BGC-823胃癌細(xì)胞株加入6孔板內(nèi)，過(guò)夜后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔。次日用槍頭垂直于背后的橫線劃痕。PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。加入37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱，48 h后取樣拍照，觀察細(xì)胞遷移能力。

2.5細(xì)胞凋亡測(cè)定 貼壁細(xì)胞加胰酶消化，收集離心，懸浮細(xì)胞直接收集離心。用冷的PBS洗細(xì)胞2遍，加入1×Binding Buffer 100 μL重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×109/L，加入5 μL Annexin V和10 μL PI，混勻，室溫避光15 min染色。加入1×Binding Buffer 400 μL 置于冰上，上機(jī)檢測(cè)。

2.6多重靶向載體構(gòu)建 構(gòu)建去水四環(huán)素(tetracycline, Tet)誘導(dǎo)表達(dá)的多重靶向候選miRNA的慢病毒表達(dá)載體，首先體外合成miR-29b、miR-92b及miR-106b結(jié)合位點(diǎn)(microRNA binding sites, MBSs)克隆至Tet-On載體；此MBS克隆由miR-29b、miR-92b及miR-106b對(duì)應(yīng)的各10個(gè)重復(fù)反向互補(bǔ)序列單位串聯(lián)構(gòu)成，每個(gè)miRNA的MBS用ATCG序列隔開(kāi)，在種子序列上游引入錯(cuò)配序列GCTA[以防止多西環(huán)素(doxycycline，DOX)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本被AGO2結(jié)合降解]，最后在兩邊加入內(nèi)切酶SanD I酶切位點(diǎn)。將此體外合成序列克隆至SanD I消化的Tet-On載體，完成載體構(gòu)建。將載體與包裝質(zhì)粒pVSV-G和pCMVΔR8.2共同轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，收獲高滴度病毒體。

2.7動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建DOX誘導(dǎo)表達(dá)的多重靶向候選miRNA的抑制物并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞株，取生長(zhǎng)狀態(tài)相似的健康BALB/c(nu/nu)裸小鼠共15只，將裸鼠隨機(jī)分成3組，每組5只，其中一組裸鼠接種正常的BGC-823胃癌細(xì)胞，另外兩組裸鼠接種構(gòu)建的BGC miRNATet-On細(xì)胞株(其中一組為DOX誘導(dǎo)，另一組無(wú)DOX誘導(dǎo))。接種方法：在裸鼠右背部皮下接種細(xì)胞，濃度為2×1010/L， 共0.1 mL。從接種時(shí)間開(kāi)始算起，第7天檢測(cè)腫瘤大小，第10天開(kāi)始前兩組裸鼠腹腔注射1 g/L的DOX，并在水中加入DOX喂養(yǎng)。每3 d測(cè) 1 次腫瘤大小，用卡尺測(cè)量其長(zhǎng)徑(a)和寬徑(b)，并計(jì)算體積V=ab2/2，在第32天取出腫瘤并稱重。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件比較不同組別間的差異，配對(duì)樣本間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，2組獨(dú)立樣本間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-29b、miR-92b及miR-106b與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)

采用小RNA測(cè)序分析有和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌標(biāo)本(各3例)miRNA的差異表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)， miR-29b(上調(diào)4.43倍，P=0.002)、miR-92b(上調(diào)3.31倍，P=0.004)及miR-106b(上調(diào)5.03倍，P=0.012)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，從而將它們確定為候選miRNA。對(duì)miR-29b、miR-92b及miR-106b靶基因的GO和Pathway分析提示，候選miRNA功能主要涉及細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用及PI3K信號(hào)通路等，進(jìn)一步確定候選miRNA與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The GO and Pathway analyses for target genes of candidate miRNAs.

2 miR-29b、miR-92b及miR-106b對(duì)胃癌細(xì)胞活力的影響

根據(jù)上述有/無(wú)轉(zhuǎn)移胃癌組織miRNA表達(dá)差異及生物信息學(xué)分析，我們推測(cè)miR-29b、miR-92b及miR-106b可能具有增強(qiáng)胃癌惡性行為的能力。因此，我們首先將LNA修飾的候選miRNA的ASO轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞株，封閉抑制候選miRNA，見(jiàn)圖2；并且通過(guò)CCK-8法監(jiān)測(cè)每日細(xì)胞活力的變化，確定候選miRNA對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各抑制組BGC-823胃癌細(xì)胞的活力明顯下降(P<0.01)，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性方面，見(jiàn)圖3。

Figure 2.The inhibitory effect of ASO on candidate miRNAs. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group.

Figure 3.The impact of miRNA ASO on the viability of gastric cancer cells detected by CCK-8 assay. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs NC group.

3 miR-29b、miR-92b及miR-106b對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

為探究候選miRNA促胃癌細(xì)胞活力的功能是否涉及到細(xì)胞凋亡程度的變化，我們進(jìn)一步用候選miRNA的ASO瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，再用Annexin V/PI 染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的程度。結(jié)果表明,抑制BGC-823胃癌細(xì)胞3種候選miRNA表達(dá)后，細(xì)胞總凋亡率顯著提高(P<0.01),見(jiàn)圖4。

Figure 4.The effect of miRNA ASO on the apoptosis of gastric cancer cells. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs NC group.

4 miR-29b、miR-92b及miR-106b對(duì)胃癌遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選miRNA對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，3個(gè)miRNA的ASO轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞表現(xiàn)出較低程度的劃痕愈合能力(P<0.01)，見(jiàn)圖5。Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)ASO轉(zhuǎn)染的細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少(P<0.01)，見(jiàn)圖6。這些結(jié)果表明miR-29b、miR-92b和miR-106b促進(jìn)了胃癌細(xì)胞遷移。將多條ASO聯(lián)合抑制miR-29b、miR-92b和miR-106b表達(dá)，則進(jìn)一步抑制胃癌細(xì)胞遷移能力(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 5.The effect of ASO of the candidate miRNAs on cell migration ability detected by wound healing assay (×40). Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs NC group.

Figure 6.The effect of miRNA ASO on the migration ability of BGC-823 cells detected by Transwell assay (×40). Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group.

5 聯(lián)合靶向抑制miR-29b、miR-92b及miR-106b對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響

構(gòu)建DOX誘導(dǎo)表達(dá)的多重靶向候選miRNA的抑制物并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞株，在DOX誘導(dǎo)下miR-29b、miR-92b及miR-106b的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖7。同時(shí)，利用此胃癌細(xì)胞株成功構(gòu)建了裸鼠的荷瘤模型，并且發(fā)現(xiàn)在DOX的誘導(dǎo)下BGC miRNATet-On細(xì)胞株的移植瘤逐漸縮小，甚至在第31天，該組有2只裸鼠的腫瘤幾乎消失了，而對(duì)照組細(xì)胞移植瘤則沒(méi)有出現(xiàn)類似的現(xiàn)象，見(jiàn)圖8。

討 論

胃癌的發(fā)病率居我國(guó)惡性腫瘤的首位，手術(shù)為主的綜合治療仍是目前治療胃癌的首選方法，但進(jìn)展期胃癌的治療效果并不理想，III期胃癌的5年生存率只有15%～30%，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌死亡率居高不下的主要原因，盲目擴(kuò)大手術(shù)根治范圍并不能改善患者的預(yù)后[1]，因此尋找干預(yù)胃癌轉(zhuǎn)移的有效途徑意義深遠(yuǎn)。

Figure 7.The inhibitory effect of multiple miRNA inhibitor on expression levels of the candidate miRNAs. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs NC group.

miRNA是近年來(lái)在多種真核細(xì)胞和病毒中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼短序列(21～23個(gè)核苷酸)RNA片段，其轉(zhuǎn)錄前體轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)在核內(nèi)被RNase III核酸酶Drosha加工成約70個(gè)核苷酸發(fā)夾狀的RNA(pre-miRNA)， 在exportin-5的幫助下從核內(nèi)進(jìn)入胞質(zhì)，然后在Dicer酶的作用下，單鏈的miRNA進(jìn)入一個(gè)核糖蛋白復(fù)合體miRNP。miRNA 通過(guò)與靶基因的3’UTR互補(bǔ)配對(duì)，指導(dǎo)miRNP復(fù)合體對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行切割或翻譯抑制，起著調(diào)控基因功能的作用，在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起到調(diào)控樞紐的作用，且序列具有相對(duì)的保守性，因此有專家預(yù)測(cè)，研究miRNA可能比研究編碼基因更加有效[1]。

Figure 8.The inhibitory effect of multiple miRNA inhibitor on tumor growth in the nude mice. A: the images of tumor size in BGC miRNATet-On DOX group; B: the tumor volume. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs BGC DOX group.

隨著高通量miRNA芯片平臺(tái)的建立和完善，常見(jiàn)腫瘤的miRNA表達(dá)譜檢測(cè)工作相繼完成，Coburn等[1]報(bào)道了胃癌的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-21、 miR-24、 miR-107、 miR-221和miR-223等在胃癌組織中顯著高表達(dá)，而miR-218-2、miR-206和miR-198等在胃癌組織中則顯著低表達(dá)。業(yè)已證明miRNA在腫瘤發(fā)生學(xué)方面發(fā)揮重要作用，而腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA的研究正處于起步階段。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移瘤中可以出現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA。有研究就肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA做了篩選工作，他們發(fā)現(xiàn)miR-338、miR-219-1、 miR-206等20條miRNA在已發(fā)生轉(zhuǎn)移的肝癌中異常表達(dá)。在乳腺癌轉(zhuǎn)移組織中出現(xiàn)miR-10b和miR-373表達(dá)上調(diào)，而miR-335和miR-126呈下調(diào)改變，其具體的調(diào)控機(jī)制仍在探索之中。本研究中，我們采用小RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)miR-29b、miR-92b及miR-106b與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較為相關(guān)，并將它們確定為候選miRNA。對(duì)miR-29b、miR-92b及miR-106b靶基因的GO和Pathway分析提示，候選miRNA功能主要涉及細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用及PI3K信號(hào)通路等，進(jìn)一步確定了候選miRNA與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。

近年來(lái)，相關(guān)miRNA生物功能學(xué)研究也不斷深入，通過(guò)干預(yù)癌基因或(和)抑癌基因的表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等生物程序的調(diào)控。已有研究發(fā)現(xiàn)，let-7可與其靶標(biāo)致癌基因ras和myc互補(bǔ)配對(duì)從而下調(diào)ras和myc的表達(dá)，抑制其翻譯過(guò)程[3]。miR-21可能通過(guò)抑制抑癌基因原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)還有多個(gè)參與細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的基因被證實(shí)是miR-21 的調(diào)控靶標(biāo)，如miR-21 通過(guò)負(fù)調(diào)控抑癌基因第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶-張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力；高表達(dá)miR-21可以促使胃癌抑制基因RECK的下調(diào)，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生[7]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，抑制miR-29b、miR-92b及miR-106b后，BGC-823胃癌細(xì)胞增殖減弱，凋亡誘導(dǎo)增加，轉(zhuǎn)移能力顯著下降，提示候選miRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

由于動(dòng)物miRNA作用的多靶性和聯(lián)合效應(yīng)的特征，一條miRNA可以作用于上百條目的基因，而多條miRNA同樣可以共同作用于一條靶基因[2]。miR-17-92 是由7條miRNA(miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20、miR-19b-1和miR-92-1)組成的表達(dá)簇，位于一個(gè)具有開(kāi)放讀碼框的基因C13orf25內(nèi)，miR-17-92 家族與致癌基因myc協(xié)同作用，加速了腫瘤在B細(xì)胞淋巴瘤小鼠模型中的發(fā)展[8]。Bobbili等[8]研究發(fā)現(xiàn)miR-106b-25基因簇(miR-106b和miR-93)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子E2F1的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)受E2F1的反饋調(diào)節(jié)，其高表達(dá)能夠下調(diào)TGF-β的腫瘤抑制作用，干擾CDKN1A和BCL2L11基因的表達(dá)，在胃癌的發(fā)生中起重要作用。所以有必要對(duì)多條miRNA同時(shí)進(jìn)行干預(yù)。本研究中，我們成功構(gòu)建DOX誘導(dǎo)表達(dá)的多重靶向候選miRNA的抑制物，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞株，在DOX的誘導(dǎo)下BGC miRNATet-On細(xì)胞株的移植瘤逐漸減少，甚至在第31天，該組有2只裸鼠的腫瘤幾乎消失了，而對(duì)照組細(xì)胞移植瘤則沒(méi)有出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-29b、miR-92b及miR-106b與胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，聯(lián)合阻斷上述miRNA可明顯抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)，為今后開(kāi)發(fā)靶向miRNA治療胃癌轉(zhuǎn)移的藥物提供依據(jù)。