亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        Ang(1-7)減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞損傷*

        2018-11-26 07:39:06陸春麗胡東輝褚加成周夏利陳巍巍孫明謹(jǐn)
        中國病理生理雜志 2018年11期
        關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激胰島素功能

        陸春麗, 胡東輝, 褚加成, 周夏利, 陳巍巍, 孫明謹(jǐn)

        (湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院內(nèi)分泌科, 湖北 隨州 441300)

        胰腺局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)的活性對胰島β細(xì)胞的存活與正常功能的維持有重要的調(diào)控作用,而維持其功能的正常有賴于RAS內(nèi)2條通路的自穩(wěn)平衡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病前期及糖尿病期的動(dòng)物模型中,胰腺局部RAS系統(tǒng)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)-血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)-血管緊張素II 1型受體(angiotensin II type 1 receptors,AT1R) 及ACE2-Ang(1-7)-Mas軸失衡,參與了胰島局部的炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)[1-3]; 敲除小鼠ACE2基因加重了長期高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的糖耐量減低,增加了胰島β細(xì)胞功能損害[2],但其涉及機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究擬探討Ang(1-7)對棕櫚酸(palmitic acid,PA)培養(yǎng)的小鼠胰島β細(xì)胞的影響及其相關(guān)機(jī)制,為糖尿病的早期防治和β細(xì)胞功能的保護(hù)提供新思路。

        材 料 和 方 法

        1 主要材料

        小鼠胰島β細(xì)胞(Min6細(xì)胞)購自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco;雷帕霉素(rapamycin,Rap)購自Sigma;活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒購自碧云天公司;Ang(1-7)和 A779均購自上海吉爾生化有限公司;小鼠胰島素ELISA試劑盒購自Cusabio;抗GAPDH和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)抗體購自Abcam。

        2 方法

        2.1細(xì)胞培養(yǎng) Min6細(xì)胞于含12%胎牛血清的培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次,細(xì)胞融合至80%時(shí)用0.25%胰酶消化傳代。

        2.2棕櫚酸的配制 將棕櫚酸溶于濃度為100 mmol/L的NaOH中,用不含脂肪酸的BSA溶液調(diào)節(jié)至10 mmol/L,過濾并加入到無血清培養(yǎng)基中以達(dá)到0.5 mmol/L棕櫚酸/1% BSA的終濃度。

        2.3細(xì)胞干預(yù) 將對數(shù)生長期細(xì)胞按每孔1×106的密度接種至6孔板,隨機(jī)分為:(1)對照(control)組:加入生理鹽水;(2)PA組:0.5 mmol/L棕櫚酸干預(yù)48 h;(3)PA+Ang(1-7)組: 10-8mmol/L Ang(1-7)+0.5 mmol/L棕櫚酸;(4)PA+Ang(1-7)+A779組:10-8mmol/L Ang(1-7)+0.5 mmol/L棕櫚酸+10-6mmol/L A779;(5)PA+Ang(1-7)+Rap組: 10-8mmol/L Ang(1-7)+0.5 mmol/L棕櫚酸+5 μmol/L rapamycin;(6)Ang(1-7)組:10-8mmol/L Ang(1-7);(7)A779組:10-6mmol/L A779。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基,按分組分別給予不同干預(yù),干預(yù)完成后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞待測。

        2.4葡萄糖刺激的胰島素釋放實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)過不同處理后的Min6細(xì)胞,用不含糖的KRBH緩沖液于37 ℃孵育30 min后去上清;再分別加入0.5 mL含2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖的KRBH液于37 ℃孵育1 h,取上清離心按試劑盒說明書檢測胰島素。

        2.5ROS水平的檢測 收集經(jīng)過不同處理后Min6細(xì)胞,按試劑盒說明書操作,使用熒光酶標(biāo)儀檢測ROS水平。

        2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 0.25%的胰酶消化細(xì)胞后,收集培養(yǎng)基內(nèi)及消化后脫落的細(xì)胞于10 mL的離心管內(nèi),PBS沖洗2次。棄去上清,PBS重懸細(xì)胞沉淀,300×g離心5 min,重復(fù)3次。收集細(xì)胞沉淀,加入Binding Buffer 300 μL,重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC,混勻后避光孵育10 min,加入5 μL PI,混勻后避光孵育5 min后上流式細(xì)胞儀檢測。

        2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 取處理完成的細(xì)胞用TBS緩沖液潤洗3次,加入RIPA裂解液裂解3~5 min。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下,收集至離心管中。冰浴30 min。4 ℃、13 000×g離心5 min,收集上清,即為總蛋白溶液。BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE電泳,每孔上樣40 μg蛋白,后轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入 I 抗和II抗孵育后,顯影、定影并分析目標(biāo)帶的吸光度(A)值。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多個(gè)樣本的均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 各組Min6細(xì)胞分泌功能的變化

        與對照組相比,棕櫚酸培養(yǎng)后Min6細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素分泌均升高(P<0.05),而葡萄糖刺激后胰島素分泌均顯著降低(P<0.05)。與棕櫚酸干預(yù)組相比,棕櫚酸培養(yǎng)的Min6細(xì)胞同時(shí)給予Ang(1-7)干預(yù)后,Min6細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素分泌無明顯改變,但葡萄糖刺激后胰島素分泌明顯增加(P<0.05),PA+Ang(1-7)+A779組葡萄糖刺激后胰島素分泌與PA+Ang(1-7)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,PA+Ang(1-7)+Rap組葡萄糖刺激后胰島素分泌較PA+Ang(1-7)組明顯減少(P<0.05)。Ang(1-7)組和A779組的基礎(chǔ)胰島素分泌和葡萄糖刺激后胰島素分泌與control組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖1。

        2 各組Min6細(xì)胞凋亡的改變

        為了研究Ang(1-7)對棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞存活狀態(tài)的影響,我們檢測了各組Min6細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果顯示,與control組相比,PA組的Min6細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05);而PA+Ang(1-7)組的凋亡率較PA組顯著減少(P<0.05);而加入A779后,Ang(1-7)改善棕櫚酸誘導(dǎo)Min6細(xì)胞凋亡的作用被阻斷。Ang(1-7)組和A779組的Min6細(xì)胞凋亡與control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,見圖2。

        Figure 1.The comparison of secretion function in each group. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; ?P<0.05 vs PA group; #P<0.05 vs PA+Ang(1-7) group.

        為進(jìn)一步驗(yàn)證Ang(1-7)對棕櫚酸培養(yǎng)的Min6細(xì)胞的保護(hù)作用是否通過抑制自噬活性介導(dǎo),PA+Ang(1-7)+Rap組在給予Ang(1-7)干預(yù)同時(shí)加入自噬誘導(dǎo)劑rapamycin,結(jié)果顯示,PA+Ang(1-7)+Rap組的Min6細(xì)胞凋亡較PA+Ang(1-7)組明顯增多(P<0.05),提示Ang(1-7)可明顯減弱棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞凋亡,rapamycin可部分削弱Ang(1-7)對Min6細(xì)胞這一保護(hù)作用,見圖2。

        3 Ang(1-7)抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

        與control相比,棕櫚酸干預(yù)后PA組的Min6細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.05),提示氧化應(yīng)激水平明顯增加;而PA+Ang(1-7)組的Min6細(xì)胞內(nèi)ROS水平較PA組顯著降低(P<0.05),提示Ang(1-7)減輕了棕櫚酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。PA+Ang(1-7)+Rap組的ROS水平較PA+Ang(1-7)組亦顯著升高(P<0.05),提示Ang(1-7)抑制Min6細(xì)胞中棕櫚酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用部分可被rapamycin阻斷,見圖3。

        Figure 3.The comparison of ROS in different groups. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group;&P<0.05vsPA+Ang(1-7) group.

        圖3各組細(xì)胞ROS水平的比較

        4 Ang(1-7)抑制Min6細(xì)胞中棕櫚酸誘導(dǎo)的自噬

        與control組相比,PA組Min6細(xì)胞的LC3-II/LC3-I比值顯著升高(P<0.05),提示棕櫚酸干預(yù)引起Min6細(xì)胞自噬活性增強(qiáng);PA+Ang(1-7)組的LC3-II/LC3-I較PA組明顯降低(P<0.05),提示Ang(1-7)抑制了棕櫚酸誘導(dǎo)的自噬活性;PA+Ang(1-7)+Rap組的LC3-II/LC3-I較PA+Ang(1-7)組明顯升高(P<0.05),提示rapamycin可明顯削弱Ang(1-7)對棕櫚酸誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,見圖4。

        Figure 4.The comparison of LC3-II/LC3-I ratio in each group. Mean±SD. n=7. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs PA group; &P<0.05 vs PA+Ang(1-7) group.

        5 Mas受體拮抗劑對Ang(1-7)介導(dǎo)的Min6細(xì)胞保護(hù)作用及自噬活性的影響

        為檢測Ang(1-7)對棕櫚酸培養(yǎng)的Min6細(xì)胞的保護(hù)作用是否通過G蛋白偶聯(lián)受體Mas介導(dǎo),我們同時(shí)給予選擇性Mas受體拮抗劑A779干預(yù),結(jié)果表明A779阻滯了Ang(1-7)對棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞的有益作用及對自噬活性的影響,見圖1~4。

        討 論

        Ang(1-7)是ACE2-Ang(1-7)-Mas軸的主要活性成分,是ACE2水解Ang I和Ang II的主要產(chǎn)物,通過與特異性受體Mas結(jié)合,在體內(nèi)外起到拮抗AngⅡ活性的作用[4]。最新研究表明,Ang(1-7)可減少H2O2誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的ROS生成,增加線粒體膜電位和葡萄糖刺激的鈣水平,減輕H2O2誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[5];并在體內(nèi)外均有改善小鼠胰島胰島素分泌的作用[6]。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn),通過基因敲除手段下調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas活性后,加重了高脂飲食誘導(dǎo)的胰島功能損害及胰島局部炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[3],但其涉及的具體機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,棕櫚酸干預(yù)可明顯誘導(dǎo)Min6細(xì)胞功能損傷,細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高,氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng);經(jīng)Ang(1-7)干預(yù)后可明顯降低ROS水平,并有效改善Min6細(xì)胞分泌功能及存活狀態(tài),提示Ang(1-7)可能通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS形成而發(fā)揮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞損傷作用。

        近年來,自噬被認(rèn)為是調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能和死亡的新機(jī)制。自噬為細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制,可清除胞內(nèi)受損線粒體和異常折疊的蛋白質(zhì),對于維持β細(xì)胞數(shù)量和功能、防止細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)胰島素分泌起重要作用[7]。在應(yīng)激情況下,自噬被過度激活則會(huì)加速β細(xì)胞死亡。從2型糖尿病的患者胰腺中分離出來的胰島內(nèi)自噬活性受損,自噬泡和自噬體的密度體積顯著高于正常的β細(xì)胞[8]。

        在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,ROS升高可通過多種分子信號通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生,而自噬激活后也可通過清除被ROS損傷的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)等途徑來降低ROS對細(xì)胞的毒性作用[9]。ROS介導(dǎo)的細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)并不是持續(xù)發(fā)揮積極作用,當(dāng)ROS水平超出自噬范圍,自噬會(huì)被過度激活,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入自噬性細(xì)胞死亡[10]。從本研究結(jié)果分析,在經(jīng)Ang(1-7)干預(yù)后,棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞分泌功能受損明顯改善,凋亡減少,細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低,自噬相關(guān)蛋白表達(dá)下降,推測Ang(1-7)可能通過減少ROS形成,抑制ROS誘導(dǎo)的過度自噬,從而減少過度自噬帶來的不良后果。

        為進(jìn)一步驗(yàn)證Ang(1-7)對Min6細(xì)胞保護(hù)作用與自噬活性關(guān)系,我們運(yùn)用自噬誘導(dǎo)劑rapamycin干預(yù)發(fā)現(xiàn),rapamycin可明顯削弱Ang(1-7)對棕櫚酸損傷Min6細(xì)胞的保護(hù)作用,并有效地干擾了Ang(1-7)對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。由此我們推測在棕櫚酸干預(yù)下,Ang(1-7)對Min6細(xì)胞的保護(hù)作用與自噬活性抑制存在一定關(guān)聯(lián)。

        綜上所述,我們的研究首次報(bào)道Ang(1-7)對棕櫚酸損傷的Min6細(xì)胞具有保護(hù)作用,其保護(hù)機(jī)制可能部分通過抑制ROS介導(dǎo)的自噬活性來實(shí)現(xiàn)。這為以ACE2-Ang(1-7)-Mas軸介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞自噬作用為干預(yù)靶點(diǎn)保護(hù)β細(xì)胞功能提供新的理論依據(jù)。

        猜你喜歡
        氧化應(yīng)激胰島素功能
        也談詩的“功能”
        中華詩詞(2022年6期)2022-12-31 06:41:24
        基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
        自己如何注射胰島素
        關(guān)于非首都功能疏解的幾點(diǎn)思考
        氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
        門冬胰島素30聯(lián)合二甲雙胍治療老年初診2型糖尿病療效觀察
        糖尿病的胰島素治療
        氧化應(yīng)激與結(jié)直腸癌的關(guān)系
        中西醫(yī)結(jié)合治療甲狀腺功能亢進(jìn)癥31例
        辨證施護(hù)在輕度認(rèn)知功能損害中的應(yīng)用
        女优一区二区三区在线观看| 天堂69亚洲精品中文字幕| 精品国产亚洲av成人一区| 在线免费观看蜜桃视频| 欧美激情一区二区三区| 国产成人精品成人a在线观看| www.91久久| 女主播国产专区在线观看| 一本一道vs无码中文字幕| 成人网站免费大全日韩国产| 亚洲中文字幕巨乳人妻| 激情五月六月婷婷俺来也| 真实的国产乱xxxx在线| 亚洲精品成人网站在线观看| 国产真实乱对白在线观看| 国产夫妻精品自拍视频| 久久亚洲av成人无码电影a片| 伴郎粗大的内捧猛烈进出视频观看| 一区二区三区国产在线网站视频| 在线观看二区视频网站二区| 又色又爽又黄的视频软件app| 亚洲精品毛片一区二区三区 | 久久久人妻一区二区三区蜜桃d| 日日拍夜夜嗷嗷叫国产| 国产成人精品无码播放| 一本色道久久综合中文字幕| 精品国产一区二区三区av免费| 国产成人精品午夜视频| 国产成年无码V片在线| 久久少妇呻吟视频久久久| 丰满人妻一区二区三区视频| 超薄丝袜足j好爽在线观看| 中国精品视频一区二区三区| 久久综合伊人有码一区中文字幕| 成人精品一区二区三区电影| 粗了大了 整进去好爽视频| 日本精品人妻在线观看| 男女裸体做爰视频高清| 国产女主播喷水视频在线观看| 精品免费一区二区三区在 | 一二三四五区av蜜桃|