陸春麗， 胡東輝， 褚加成， 周夏利， 陳巍巍， 孫明謹(jǐn)

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院內(nèi)分泌科， 湖北 隨州 441300)

胰腺局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的活性對胰島β細(xì)胞的存活與正常功能的維持有重要的調(diào)控作用，而維持其功能的正常有賴于RAS內(nèi)2條通路的自穩(wěn)平衡。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病前期及糖尿病期的動(dòng)物模型中，胰腺局部RAS系統(tǒng)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)-血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)-血管緊張素II 1型受體(angiotensin II type 1 receptors，AT1R) 及ACE2-Ang(1-7)-Mas軸失衡，參與了胰島局部的炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)[1-3]; 敲除小鼠ACE2基因加重了長期高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的糖耐量減低，增加了胰島β細(xì)胞功能損害[2]，但其涉及機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研究擬探討Ang(1-7)對棕櫚酸(palmitic acid,PA)培養(yǎng)的小鼠胰島β細(xì)胞的影響及其相關(guān)機(jī)制，為糖尿病的早期防治和β細(xì)胞功能的保護(hù)提供新思路。

材 料 和 方 法

1 主要材料

小鼠胰島β細(xì)胞(Min6細(xì)胞)購自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清均購自Gibco；雷帕霉素(rapamycin,Rap)購自Sigma;活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自碧云天公司；Ang(1-7)和 A779均購自上海吉爾生化有限公司；小鼠胰島素ELISA試劑盒購自Cusabio；抗GAPDH和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)抗體購自Abcam。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) Min6細(xì)胞于含12%胎牛血清的培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，細(xì)胞融合至80%時(shí)用0.25%胰酶消化傳代。

2.2棕櫚酸的配制 將棕櫚酸溶于濃度為100 mmol/L的NaOH中，用不含脂肪酸的BSA溶液調(diào)節(jié)至10 mmol/L，過濾并加入到無血清培養(yǎng)基中以達(dá)到0.5 mmol/L棕櫚酸/1% BSA的終濃度。

2.3細(xì)胞干預(yù) 將對數(shù)生長期細(xì)胞按每孔1×106的密度接種至6孔板，隨機(jī)分為：(1)對照(control)組：加入生理鹽水；(2)PA組:0.5 mmol/L棕櫚酸干預(yù)48 h；(3)PA+Ang(1-7)組: 10-8mmol/L Ang(1-7)+0.5 mmol/L棕櫚酸；(4)PA+Ang(1-7)+A779組：10-8mmol/L Ang(1-7)+0.5 mmol/L棕櫚酸+10-6mmol/L A779；(5)PA+Ang(1-7)+Rap組： 10-8mmol/L Ang(1-7)+0.5 mmol/L棕櫚酸+5 μmol/L rapamycin；(6)Ang(1-7)組：10-8mmol/L Ang(1-7)；(7)A779組：10-6mmol/L A779。細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，按分組分別給予不同干預(yù)，干預(yù)完成后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞待測。

2.4葡萄糖刺激的胰島素釋放實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)過不同處理后的Min6細(xì)胞，用不含糖的KRBH緩沖液于37 ℃孵育30 min后去上清；再分別加入0.5 mL含2.8 mmol/L和16.7 mmol/L葡萄糖的KRBH液于37 ℃孵育1 h，取上清離心按試劑盒說明書檢測胰島素。

2.5ROS水平的檢測 收集經(jīng)過不同處理后Min6細(xì)胞，按試劑盒說明書操作，使用熒光酶標(biāo)儀檢測ROS水平。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 0.25%的胰酶消化細(xì)胞后，收集培養(yǎng)基內(nèi)及消化后脫落的細(xì)胞于10 mL的離心管內(nèi)，PBS沖洗2次。棄去上清，PBS重懸細(xì)胞沉淀，300×g離心5 min，重復(fù)3次。收集細(xì)胞沉淀，加入Binding Buffer 300 μL，重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后避光孵育10 min，加入5 μL PI，混勻后避光孵育5 min后上流式細(xì)胞儀檢測。

2.7Western blot實(shí)驗(yàn) 取處理完成的細(xì)胞用TBS緩沖液潤洗3次，加入RIPA裂解液裂解3～5 min。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集至離心管中。冰浴30 min。4 ℃、13 000×g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，每孔上樣40 μg蛋白，后轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入 I 抗和II抗孵育后，顯影、定影并分析目標(biāo)帶的吸光度(A)值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多個(gè)樣本的均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組Min6細(xì)胞分泌功能的變化

與對照組相比，棕櫚酸培養(yǎng)后Min6細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素分泌均升高(P<0.05)，而葡萄糖刺激后胰島素分泌均顯著降低(P<0.05)。與棕櫚酸干預(yù)組相比，棕櫚酸培養(yǎng)的Min6細(xì)胞同時(shí)給予Ang(1-7)干預(yù)后，Min6細(xì)胞基礎(chǔ)胰島素分泌無明顯改變，但葡萄糖刺激后胰島素分泌明顯增加(P<0.05)，PA+Ang(1-7)+A779組葡萄糖刺激后胰島素分泌與PA+Ang(1-7)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，PA+Ang(1-7)+Rap組葡萄糖刺激后胰島素分泌較PA+Ang(1-7)組明顯減少(P<0.05)。Ang(1-7)組和A779組的基礎(chǔ)胰島素分泌和葡萄糖刺激后胰島素分泌與control組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

2 各組Min6細(xì)胞凋亡的改變

為了研究Ang(1-7)對棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞存活狀態(tài)的影響，我們檢測了各組Min6細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果顯示，與control組相比，PA組的Min6細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；而PA+Ang(1-7)組的凋亡率較PA組顯著減少(P<0.05)；而加入A779后，Ang(1-7)改善棕櫚酸誘導(dǎo)Min6細(xì)胞凋亡的作用被阻斷。Ang(1-7)組和A779組的Min6細(xì)胞凋亡與control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 1.The comparison of secretion function in each group. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; ?P<0.05 vs PA group; #P<0.05 vs PA+Ang(1-7) group.

為進(jìn)一步驗(yàn)證Ang(1-7)對棕櫚酸培養(yǎng)的Min6細(xì)胞的保護(hù)作用是否通過抑制自噬活性介導(dǎo)，PA+Ang(1-7)+Rap組在給予Ang(1-7)干預(yù)同時(shí)加入自噬誘導(dǎo)劑rapamycin，結(jié)果顯示，PA+Ang(1-7)+Rap組的Min6細(xì)胞凋亡較PA+Ang(1-7)組明顯增多(P<0.05)，提示Ang(1-7)可明顯減弱棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞凋亡，rapamycin可部分削弱Ang(1-7)對Min6細(xì)胞這一保護(hù)作用，見圖2。

3 Ang(1-7)抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

與control相比，棕櫚酸干預(yù)后PA組的Min6細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(P<0.05)，提示氧化應(yīng)激水平明顯增加；而PA+Ang(1-7)組的Min6細(xì)胞內(nèi)ROS水平較PA組顯著降低(P<0.05)，提示Ang(1-7)減輕了棕櫚酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。PA+Ang(1-7)+Rap組的ROS水平較PA+Ang(1-7)組亦顯著升高(P<0.05)，提示Ang(1-7)抑制Min6細(xì)胞中棕櫚酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用部分可被rapamycin阻斷，見圖3。

Figure 3.The comparison of ROS in different groups. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA group;&P<0.05vsPA+Ang(1-7) group.

圖3各組細(xì)胞ROS水平的比較

4 Ang(1-7)抑制Min6細(xì)胞中棕櫚酸誘導(dǎo)的自噬

與control組相比，PA組Min6細(xì)胞的LC3-II/LC3-I比值顯著升高(P<0.05)，提示棕櫚酸干預(yù)引起Min6細(xì)胞自噬活性增強(qiáng);PA+Ang(1-7)組的LC3-II/LC3-I較PA組明顯降低(P<0.05)，提示Ang(1-7)抑制了棕櫚酸誘導(dǎo)的自噬活性;PA+Ang(1-7)+Rap組的LC3-II/LC3-I較PA+Ang(1-7)組明顯升高(P<0.05)，提示rapamycin可明顯削弱Ang(1-7)對棕櫚酸誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，見圖4。

Figure 4.The comparison of LC3-II/LC3-I ratio in each group. Mean±SD. n=7. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs PA group; &P<0.05 vs PA+Ang(1-7) group.

5 Mas受體拮抗劑對Ang(1-7)介導(dǎo)的Min6細(xì)胞保護(hù)作用及自噬活性的影響

為檢測Ang(1-7)對棕櫚酸培養(yǎng)的Min6細(xì)胞的保護(hù)作用是否通過G蛋白偶聯(lián)受體Mas介導(dǎo)，我們同時(shí)給予選擇性Mas受體拮抗劑A779干預(yù)，結(jié)果表明A779阻滯了Ang(1-7)對棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞的有益作用及對自噬活性的影響，見圖1～4。

討 論

Ang(1-7)是ACE2-Ang(1-7)-Mas軸的主要活性成分，是ACE2水解Ang I和Ang II的主要產(chǎn)物，通過與特異性受體Mas結(jié)合，在體內(nèi)外起到拮抗AngⅡ活性的作用[4]。最新研究表明，Ang(1-7)可減少H2O2誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的ROS生成，增加線粒體膜電位和葡萄糖刺激的鈣水平，減輕H2O2誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]；并在體內(nèi)外均有改善小鼠胰島胰島素分泌的作用[6]。本課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn)，通過基因敲除手段下調(diào)ACE2-Ang(1-7)-Mas活性后，加重了高脂飲食誘導(dǎo)的胰島功能損害及胰島局部炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]，但其涉及的具體機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，棕櫚酸干預(yù)可明顯誘導(dǎo)Min6細(xì)胞功能損傷，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)；經(jīng)Ang(1-7)干預(yù)后可明顯降低ROS水平，并有效改善Min6細(xì)胞分泌功能及存活狀態(tài)，提示Ang(1-7)可能通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS形成而發(fā)揮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞損傷作用。

近年來，自噬被認(rèn)為是調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能和死亡的新機(jī)制。自噬為細(xì)胞的一種自我保護(hù)機(jī)制，可清除胞內(nèi)受損線粒體和異常折疊的蛋白質(zhì)，對于維持β細(xì)胞數(shù)量和功能、防止細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)胰島素分泌起重要作用[7]。在應(yīng)激情況下，自噬被過度激活則會(huì)加速β細(xì)胞死亡。從2型糖尿病的患者胰腺中分離出來的胰島內(nèi)自噬活性受損，自噬泡和自噬體的密度體積顯著高于正常的β細(xì)胞[8]。

在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS升高可通過多種分子信號通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生，而自噬激活后也可通過清除被ROS損傷的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)等途徑來降低ROS對細(xì)胞的毒性作用[9]。ROS介導(dǎo)的細(xì)胞自噬活性增強(qiáng)并不是持續(xù)發(fā)揮積極作用，當(dāng)ROS水平超出自噬范圍，自噬會(huì)被過度激活，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入自噬性細(xì)胞死亡[10]。從本研究結(jié)果分析，在經(jīng)Ang(1-7)干預(yù)后,棕櫚酸誘導(dǎo)的Min6細(xì)胞分泌功能受損明顯改善，凋亡減少，細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)下降，推測Ang(1-7)可能通過減少ROS形成，抑制ROS誘導(dǎo)的過度自噬，從而減少過度自噬帶來的不良后果。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Ang(1-7)對Min6細(xì)胞保護(hù)作用與自噬活性關(guān)系，我們運(yùn)用自噬誘導(dǎo)劑rapamycin干預(yù)發(fā)現(xiàn)，rapamycin可明顯削弱Ang(1-7)對棕櫚酸損傷Min6細(xì)胞的保護(hù)作用，并有效地干擾了Ang(1-7)對自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。由此我們推測在棕櫚酸干預(yù)下，Ang(1-7)對Min6細(xì)胞的保護(hù)作用與自噬活性抑制存在一定關(guān)聯(lián)。

綜上所述，我們的研究首次報(bào)道Ang(1-7)對棕櫚酸損傷的Min6細(xì)胞具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能部分通過抑制ROS介導(dǎo)的自噬活性來實(shí)現(xiàn)。這為以ACE2-Ang(1-7)-Mas軸介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞自噬作用為干預(yù)靶點(diǎn)保護(hù)β細(xì)胞功能提供新的理論依據(jù)。