燕林貞， 燕欽棟， 張順祥， 丁小青， 李 康

(1山東省東營市廣饒縣人民醫(yī)院心內(nèi)科， 山東 東營 257300； 2山東省東營市東城醫(yī)院心內(nèi)科， 山東 東營 257091)

心肌梗死是一種常見的心血管系統(tǒng)疾病，臨床上對于心肌梗死的研究已經(jīng)有近百年的歷史，雖然取得了一定的成效，但其發(fā)病機制仍在探索之中。目前臨床上常見的治療方法為經(jīng)皮冠狀動脈介入治療，這種治療方法雖然具有一定的成效，但往往會造成缺血再灌注損傷，加重心肌損傷，使患者出現(xiàn)心力衰竭和心律失常等癥狀。心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷等都與缺血再灌注損傷有關(guān)[1-2]。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)具有雙磷酸酶活性，在細(xì)胞生長和凋亡等過程中具有重要作用，參與胚胎發(fā)育，與動脈粥樣硬化、糖尿病心肌病、腫瘤、腦血管疾病和心肌缺血再灌注等疾病發(fā)生有關(guān)[3-5]。研究顯示，PTEN在缺血再灌注大鼠心肌組織中表達(dá)上調(diào)，可能與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。本研究構(gòu)建體外心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧 (anoxia/reoxygenation，A/R)損傷模型，通過小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)下調(diào)心肌細(xì)胞中PTEN的水平，探討PTEN在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷中的作用，為研究心肌缺血再灌注發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

H9c2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。Lipofectamine 2000購自Thermo Fisher Scientific；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒購自Sigma；胎牛血清購自杭州四季青；PTENsiRNA1、PTENsiRNA2和siRNA control購自上海西寶生物科技有限公司；抗PTEN多克隆抗體、抗cleaved caspase-3多克隆抗體、抗Bax多克隆抗體和抗FasL多克隆抗體購自Abcam；丙二醛(malondialedhyde，MDA)活性檢測試劑盒購自上海信帆生物；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性檢測試劑盒購自于碧云天；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)含量檢測試劑盒和白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA檢測試劑盒購自于上海晶抗；白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA檢測試劑盒購自于上海紀(jì)寧。

2 方法

2.1缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型的建立 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)用含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細(xì)胞密度超過80%以后，用含有0.05%的胰蛋白酶消化傳代。缺氧復(fù)氧模型構(gòu)建方法如下：H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、 5% CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中，細(xì)胞密度超過80%以后，將原培養(yǎng)液吸除，加入等量不含血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、 5% CO2、95%N2的缺氧培養(yǎng)箱中孵育4 h。把原來的培養(yǎng)液吸除后，加入10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放在37 ℃、 5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，即為缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型[7]。

2.2細(xì)胞分組 H9c2細(xì)胞分為：H9c2組、H9c2+A/R組、陰性對照轉(zhuǎn)染(normal control，NC)組、NC+A/R組、siRNA1+A/R組和siRNA2+A/R組。H9c2組為H9c2細(xì)胞不經(jīng)缺氧復(fù)氧處理，不經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染；H9c2+A/R組為H9c2細(xì)胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理，不經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染；NC組為H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA control，不經(jīng)缺氧復(fù)氧處理；NC+A/R組為H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA control，經(jīng)缺氧復(fù)氧處理；siRNA1+A/R組為H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTENsiRNA1，經(jīng)缺氧復(fù)氧處理；siRNA2+A/R組為H9c2細(xì)胞轉(zhuǎn)染PTENsiRNA2，經(jīng)缺氧復(fù)氧處理。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，進行缺氧復(fù)氧處理。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 把H9c2細(xì)胞種植到6孔板中，每孔添加1×105個細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞密度為50%時進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。把Lipofectamine 2000同Opti-MEM混勻后，在室溫環(huán)境下孵育5 min。取PTENsiRNA1、PTENsiRNA2和siRNA control分別與Opti-MEM混合。將上述2種混合物在室溫中孵育20 min，添加到細(xì)胞中，孵育6 h后，更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液。

2.4RT-PCR實驗 取各組心肌細(xì)胞，按照TRIzol法提取細(xì)胞中的RNA，紫外分光光度計測定A260和A280值，測定RNA的質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用RT-PCR檢測PTEN水平，內(nèi)參照β-actin的上游引物為5’-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3’，下游引物為5’-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3’；PTEN上游引物為5’-TCATGGTGCTGGTGGCTCTG-3’，下游引物為5’-TGTGCTGGGGTTGGCTATTT-3’。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s， 40個循環(huán)。

2.5Western blot實驗 取各組心肌細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法對蛋白進行定量檢測，配制分離膠(10%)和濃縮膠(5%)。按照每孔中添加20 μL的蛋白樣品，把蛋白與上樣緩沖液混勻后，在100 ℃煮沸5 min。80 V條件下電泳，溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠的邊緣時，把電壓調(diào)整到120 V，關(guān)閉電泳。3 mA/cm2轉(zhuǎn)膜2 h。與5%脫脂奶粉在室溫反應(yīng)2 h，按1∶1 000稀釋抗β-actin抗體，按1∶600稀釋抗PTEN、cleaved caspase-3、Bax和FasL抗體，4 ℃孵育過夜后，放在1∶3 000稀釋的 II 抗中在室溫結(jié)合2 h。ECL化學(xué)發(fā)光，曝光30 s，用Image-Pro Plus分析蛋白含量，用目的蛋白/β-actin表示蛋白含量。

2.6MTT法檢測細(xì)胞活力 將NC、NC+A/R和siRNA2+A/R組細(xì)胞種植到96孔板中，按照2.2中處理后，每組設(shè)置5個復(fù)孔，每個孔中加入100 μL的細(xì)胞懸浮液，缺氧復(fù)氧處理后，把原來的培養(yǎng)液吸除以后，加入PBS把細(xì)胞漂洗3次，每孔中依次加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h以后，停止培養(yǎng)。將原來的培養(yǎng)液吸除以后，依次在每孔中添加150 μL的二甲基亞砜溶液，在避光條件下孵育10 min，放置到酶標(biāo)儀上測定吸光度(A)值，以不加入細(xì)胞的孔調(diào)零。細(xì)胞相對活力(%)=待測孔A/對照孔A×100%。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將NC、NC+A/R和siRNA2+A/R各組細(xì)胞分組處理后，用PBS洗滌3次，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，在細(xì)胞中添加500 μL的Binding Buffer混合后，在細(xì)胞中添加Annexin V-FITC 5 μL，再添加5 μL的PI，放置于室溫環(huán)境中避光反應(yīng)10 min。立即用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平。

2.8LDH、SOD和MDA水平的檢測 將NC、NC+A/R和siRNA2+A/R各組細(xì)胞按照2.2中處理后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，用試劑盒進行檢測。用黃嘌呤氧化法測定細(xì)胞中SOD活性，用硫代巴比妥酸法測定MDA活性，用二硝基苯肼法測定培養(yǎng)液上清中LDH活性。

2.9TNF-α、IL-1β和IL-6水平的檢測 將NC、NC+A/R和siRNA2+A/R各組細(xì)胞按照2.2中處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用ELISA測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平，步驟參照試劑盒說明書。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平

H9c2細(xì)胞經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后細(xì)胞中PTEN的mRNA和蛋白水平明顯高于正常培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞(P<0.05)，見圖1。這提示PTEN在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。

Figure 1.The mRNA (A) and protein (B) expression levels of PTEN in the H9c2 cells after anoxia/reoxygenation (A/R). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs H9c2 group.

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)缺氧復(fù)氧處理后細(xì)胞中PTEN水平的變化

siRNA1+A/R組和siRNA2+A/R組細(xì)胞中PTEN的mRNA和蛋白水平明顯低于NC+A/R組(P<0.05)；其中siRNA2+A/R組細(xì)胞中PTEN的mRNA和蛋白水平明顯低于siRNA1+A/R組(P<0.05)，因此后續(xù)選用轉(zhuǎn)染PTENsiRNA2的心肌細(xì)胞繼續(xù)研究，見圖2。

Figure 2.The expression of PTEN at mRNA (A) and protein (B) levels in the transfected H9c2 cells treated with anoxia/reoxyge-nation (A/R). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC+A/R group; #P<0.05 vs siRNA1+A/R group.

3 PTEN表達(dá)下調(diào)對缺氧復(fù)氧處理的H9c2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力的影響

NC+A/R組細(xì)胞凋亡率明顯高于NC組，而細(xì)胞活力明顯低于NC組(P<0.05)；siRNA2+A/R組細(xì)胞凋亡率明顯低于NC+A/R組，而細(xì)胞活力明顯高于NC+A/R組(P<0.05)，見圖3。這說明缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌細(xì)胞活力，而下調(diào)PTEN可以減少心肌細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活力。

Figure 3.The effect of down-regulation of PTEN expression on the apoptosis (A) and viability (B) of H9c2 cells induced by anoxia/reoxygenation (A/R). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs NC+A/R group.

4 PTEN表達(dá)下調(diào)對缺氧復(fù)氧處理的H9c2細(xì)胞MDA含量、SOD水平和LDH漏出水平的影響

NC+A/R組細(xì)胞中MDA含量和培養(yǎng)液上清中LDH水平明顯高于NC組，而細(xì)胞中SOD活性明顯低于NC組(P<0.05)；siRNA2+A/R組細(xì)胞中MDA含量和培養(yǎng)液上清中LDH水平明顯低于NC+A/R組，而細(xì)胞中SOD活性明顯高于NC+A/R組(P<0.05)，見表1。這提示缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷，而下調(diào)PTEN可以降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷。

表1 PTEN表達(dá)下調(diào)后經(jīng)缺氧復(fù)氧的H9c2細(xì)胞中MDA含量、SOD活性和培養(yǎng)液上清中LDH水平的變化

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsNC+A/R group.

5 PTEN表達(dá)下調(diào)對缺氧復(fù)氧處理的H9c2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的影響

NC+A/R組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯高于NC組(P<0.05)；siRNA2+A/R組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯低于NC+A/R組(P<0.05)，見表2。這說明缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，而下調(diào)PTEN可以抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6。

表2 PTEN表達(dá)下調(diào)后經(jīng)缺氧復(fù)氧的H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsNC+A/R group.

6 PTEN表達(dá)下調(diào)對缺氧復(fù)氧處理的H9c2細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平的影響

NC+A/R組細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax和FasL的蛋白水平明顯高于NC組(P<0.05)；siRNA2+A/R組細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax和FasL的蛋白水平明顯低于NC+A/R組(P<0.05)，見圖4及表3。這提示缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平升高，而下調(diào)PTEN可以抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平的上調(diào)。

Figure 4.The images of Western blot for determining the protein levels of cleaved caspase-3, Bax and FasL in the H9c2 cells treated with anoxia/reoxygenation (A/R) after down-regulation of PTEN expression.

表3 PTEN表達(dá)下調(diào)后經(jīng)缺氧復(fù)氧處理H9c2細(xì)胞中cleaved caspase-3、Bax和FasL蛋白水平的變化

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsNC+A/R group.

討 論

PTEN基因定位在染色體10q23.3上，由8個內(nèi)含子及9個外顯子組成，全長為200 kb，其編碼的蛋白具有磷酸酶活性和蛋白脂酶活性，主要的功能結(jié)構(gòu)域位于N端，PTEN可以調(diào)控相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，影響細(xì)胞的生長[8-13]。研究顯示，PTEN在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生中具有重要作用，可以通過調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化等影響心肌重構(gòu)[14-16]。PTEN對于細(xì)胞的生長具有負(fù)調(diào)控作用，通過下調(diào)心肌細(xì)胞中PTEN表達(dá)可以增加參附注射液抗糖尿病心肌病效果，抑制PTEN后的心肌細(xì)胞經(jīng)高糖作用后細(xì)胞凋亡率有所降低[17-18]。有報道表明，PTEN不僅參與心肌細(xì)胞的凋亡，還與心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化有關(guān)，在維持心肌組織結(jié)構(gòu)等方面具有重要作用[19-20]。Ruan等[21]的研究表明，PTEN能夠阻礙抗凋亡信號的傳導(dǎo)，下調(diào)其表達(dá)可能是一種潛在的保護心肌缺血再灌注損傷的途徑。

心肌細(xì)胞凋亡過度是缺血再灌注損傷發(fā)生的重要病理學(xué)變化，受到多種凋亡蛋白的調(diào)控[22]。Caspase-3是caspase蛋白家族的成員，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，其在正常情況下以無活性的酶原存在，在受到細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子刺激后可以活化促進細(xì)胞凋亡發(fā)生[23]。Bax是Bcl-2蛋白家族的成員，其表達(dá)上調(diào)后發(fā)揮促凋亡作用[24]。FasL是一種與細(xì)胞凋亡有關(guān)的膜表面分子，與細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)[25]。本研究構(gòu)建了心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，發(fā)現(xiàn)PTEN在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并且心肌細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中caspase-3活化水平升高，Bax和FasL表達(dá)水平升高。通過小RNA干擾技術(shù)下調(diào)PTEN后發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PTEN后的心肌細(xì)胞經(jīng)過缺氧復(fù)氧處理后，細(xì)胞增殖活性有所升高，細(xì)胞凋亡水平下降，抑制PTEN可以降低缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡水平，增加細(xì)胞增殖活性，PTEN表達(dá)下調(diào)抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

正常的心肌細(xì)胞以有氧代謝為主，當(dāng)發(fā)生缺氧后，心肌細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH外漏，測定細(xì)胞外LDH的水平可以間接反映細(xì)胞損傷程度[26]。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，氧化損傷發(fā)生后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA水平異常升高[27]。SOD可以清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子，在維持氧化平衡、抵抗氧化損傷中具有重要作用[28]。研究顯示，心肌缺血再灌注損傷與心肌組織氧化損傷有關(guān)[29]。本研究表明，缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞SOD水平下降，MDA水平升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平也升高，心肌細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，而下調(diào)PTEN后可以部分緩解上述作用，減少氧化損傷發(fā)揮保護心肌細(xì)胞的作用。

除了心肌細(xì)胞過度凋亡、心肌組織氧化損傷之外，心肌缺血再灌注的發(fā)生還與心肌組織炎癥有關(guān)，TNF-α、IL-1β和IL-6可以促進類似于瀑布式的炎癥反應(yīng)，造成心肌組織損傷[30]。本研究表明，缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，而下調(diào)PTEN后可以減少細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6，減少炎癥因子的釋放。

PTEN在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中表達(dá)異常升高，下調(diào)其表達(dá)后可以降低缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，發(fā)揮保護心肌細(xì)胞的作用，這對于以后研究PTEN在原代缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞及缺血再灌注損傷中的作用奠定了基礎(chǔ)。