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        大鼠急性心肌梗死后NLRP3炎性體-IL-1β信號軸激活與End-MT的關(guān)系*

        2018-11-26 07:38:54湯石林劉一劍彭良善趙正亮譚一清王橋生
        中國病理生理雜志 2018年11期

        湯石林, 劉一劍, 彭良善, 趙正亮, 譚一清, 王橋生

        (1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 湖南 衡陽 421001; 2長沙市第三醫(yī)院心內(nèi)科, 湖南 長沙 410015)

        急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是指在冠狀動脈發(fā)生病理性變化基礎(chǔ)上所引發(fā)的冠脈血流急劇減少,從而導(dǎo)致心肌局部持續(xù)性缺血壞死,作為心血管領(lǐng)域常見的危重急癥之一,嚴(yán)重威脅人類健康。目前,隨著冠脈介入、溶栓及搭橋等技術(shù)及藥物治療的不斷完善,AMI的猝死風(fēng)險顯著降低,但其引發(fā)的心力衰竭(heart failure,HF)仍無有效治療手段。心肌纖維化作為HF晚期病變的共同特征,對其發(fā)生機(jī)制的深入探討,將有效改善AMI后HF進(jìn)程。

        核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎性體(inflammasome)作為細(xì)胞內(nèi)模式識別受體的重要組成部分,由NLRP3、接頭蛋白 ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain)和pro-caspase-1組成,可被多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)激活,包括微生物成分及晶體物質(zhì)如膽固醇晶體、單鈉尿酸鹽(monosodium urate,MSU)晶體、硅石等[1],其激活后促進(jìn)pro-caspase-1的自我剪切,形成具有活性的caspase-1,活化的caspase-1進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞介素1β前體(pro-interleukin-1β,pro-IL-1β)和白細(xì)胞介素18前體(pro-IL-18)水解為成熟的IL-1β和IL-18,從而發(fā)揮其對細(xì)胞功能的調(diào)控,在機(jī)體固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。近來研究發(fā)現(xiàn),NLRP3炎性體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AMI引發(fā)的心肌纖維化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3],但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

        內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition,End-MT)是指內(nèi)皮細(xì)胞在受到多種因素的作用下逐步失去其形態(tài)和功能,并獲得間充質(zhì)細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞表型的生物學(xué)過程[4]。在AMI大鼠模型中,抑制End-MT過程,心肌纖維化程度得到明顯改善[5],提示End-MT可調(diào)節(jié)AMI后心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)IL-1β作為機(jī)體內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的起始因子,在細(xì)胞水平促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長因子2的持續(xù)性產(chǎn)生與激活,后者通過觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)信號通路,促進(jìn)End-MT[6-7]。然而,在AMI后心肌纖維化過程中,NLRP3炎性體作為IL-1β的主要來源,其持續(xù)性激活與End-MT的發(fā)生發(fā)展是否存在同一性尚未明確。本研究擬在動物水平探討AMI后心肌纖維化過程中NLRP3炎性體-IL-1β信號軸和End-MT之間的關(guān)系,為進(jìn)一步改善 AMI后心肌纖維化及HF的發(fā)生發(fā)展提供新的研究思路及治療靶點(diǎn)。

        材 料 和 方 法

        1 材料與試劑

        10~12周齡雄性SD大鼠購自南華大學(xué)醫(yī)用動物實(shí)驗中心;羊抗大鼠ASC多克隆抗體和大鼠IL-1β ELISA試劑盒購自Sigma;小鼠抗大鼠CD31單克隆抗體、兔抗大鼠NLRP3多克隆抗體及兔抗大鼠caspase-1多克隆抗體購自Abcam;兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(fibroblast-specific protein 1,F(xiàn)SP1)多克隆抗體購自北京博奧森公司;小鼠抗大鼠GAPDH 單克隆抗體購自愛必信(上海)生物科技有限公司;其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

        2 方法

        2.1動物模型的構(gòu)建 30只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照(sham)組及急性心肌梗死(AMI)組(n=15)。急性心肌梗死組大鼠空腹12 h,稱重,固定,備皮,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)(呼吸頻率45次/分,呼吸比1 ∶1),測試大鼠疼痛反應(yīng),深度麻醉后行氣管插管。插管成功后,切開大鼠腹部皮膚(劍突下至左側(cè)腋下),鈍性分離肌肉及肋間肌,暴露心臟,可見心臟搏動,利用手術(shù)鑷緩慢分離心包膜,暴露心前壁,穿線結(jié)扎冠脈左前降支。結(jié)扎后肉眼可見心率減慢,結(jié)扎區(qū)域因缺血呈現(xiàn)蒼白色。假手術(shù)組按上述手術(shù)步驟進(jìn)行至前降支穿線,不結(jié)扎。依次縫合肋間切口、肌肉及皮膚。術(shù)后3 d連續(xù)肌肉注射青霉素預(yù)防感染。

        2.2動物取材 28 d后,大鼠空腹12 h,稱重,固定,備皮,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。深度麻醉后,切開大鼠腹部皮膚,鈍性分離肌肉及肋間肌,暴露心臟,將心臟取出并用生理鹽水(4 ℃)反復(fù)沖洗,直至無積血流出,分離梗死區(qū)域,取出一部分進(jìn)行蛋白提取,剩余部分固定于4%甲醛溶液,行石蠟包埋,切片。

        2.3Masson染色 將心肌切片常規(guī)脫蠟至水,Weigert蘇木素染液染核10 min;蒸餾水充分水洗3次,每次5 min,鏡下觀察(如過染,用鹽酸乙醇分化);麗春紅染液染色10 min;2%冰醋酸水溶液沖洗2 min;1%磷鉬酸水溶液分化2 min;苯胺藍(lán)染色液中染色3 min,2%冰醋酸水溶液沖洗2 min;脫水透明,中性樹膠封片,鏡下觀察,拍照。

        2.4Western blot實(shí)驗 將收集好的組織裂解;用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量;加入SDS-PAGE(5×)蛋白上樣緩沖液,沸水煮5~8 min,冷卻, -20 ℃保存?zhèn)溆?。進(jìn)行SDS-PAGE(80 V, 30 min; 120 V, 90 min);轉(zhuǎn)膜(200 mA, 2 h);TBST 封閉液(5%脫脂奶粉)封閉2 h;按比例用TBST配制抗NLRP3、ASC、caspase-1、α-SMA和GAPDH抗體,4 ℃孵育過夜;TBST洗3次,每次10 min;加入相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗,室溫孵育2 h,TBST 洗3次,每次10 min;免疫印跡熒光檢測試劑盒顯影檢測,采用自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍攝分析。

        2.5ELISA實(shí)驗 收集組織樣品,按試劑盒提供的方法,在含有IL-1β抗體的微孔板中加入100 μL待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品,室溫孵育2 h;傾除板孔內(nèi)液體,洗板3次;加入100 μL生物素標(biāo)記抗體,室溫孵育2 h;傾除板孔內(nèi)液體,洗板3次;加入HRP標(biāo)記的 II 抗,室溫孵育30 min,傾除板孔內(nèi)液體,洗板3次;加入顯色劑,室溫孵育15~20 min,終止反應(yīng)后,測定450 nm處的吸光度(A)值,計算IL-1β濃度。

        3 統(tǒng)計學(xué)處理

        以GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有實(shí)驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組間比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 AMI促進(jìn)心肌纖維化

        為進(jìn)一步驗證AMI對心肌纖維化的影響,采用Masson染色檢測心肌纖維化水平。結(jié)果顯示,AMI組心肌纖維化水平明顯增加(P<0.05),見圖1。

        Figure 1. AMI aggravated myocardial fibrosis. Myocardial fibrosis was detected by Masson staining. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.

        2 AMI促進(jìn)心肌End-MT

        Western blot結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,AMI顯著下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VE-Cadherin的表達(dá),上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和FSP1的表達(dá),見圖2。

        3 AMI后,NLRP3炎性體-IL-1β信號通路激活與End-MT具有同一性

        28 d后采用Western blot檢測受損心肌中NLRP3炎性體活性,ELISA檢測IL-1β的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)AMI組的NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1及IL-1β的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05),提示在AMI大鼠心肌發(fā)生End-MT的同時,NLRP3炎性體-IL-1β信號途徑被顯著激活,兩者進(jìn)程具有同一性,見圖3。

        討 論

        AMI作為冠心病的嚴(yán)重類型,常伴有心律失常、HF和心源性休克等一系列并發(fā)癥,具有較高的發(fā)生率及病死率,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[8]。AMI后,缺血壞死區(qū)域纖維化反應(yīng)明顯增加,并累及未受損區(qū)域,最終導(dǎo)致HF。我們研究發(fā)現(xiàn),在AMI大鼠模型中,心肌纖維化程度明顯增加。因此,控制和改善心肌纖維化進(jìn)程成為治療HF的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

        大量研究證實(shí)End-MT與心肌纖維化程度呈正相關(guān),抑制End-MT可顯著改善心肌纖維化進(jìn)程[9-10]。Western blot結(jié)果顯示,隨著AMI大鼠心肌纖維化水平的提高,其內(nèi)皮細(xì)胞正常表型逐漸丟失,并獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型,End-MT進(jìn)程加速,但在本研究中并未采用免疫組織化學(xué)染色的方法在組織中檢測End-MT的變化,存在一定局限性。同時,AMI可導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)增加,持續(xù)性的炎癥反應(yīng)又可進(jìn)一步促進(jìn)End-MT的發(fā)生發(fā)展,加速心肌纖維化及HF進(jìn)程[11]。在AMI大鼠EndMT進(jìn)展過程中,我們發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體及其下游產(chǎn)物caspase-1和IL-1β的表達(dá)也被顯著上調(diào)。NLRP3炎性體介導(dǎo)IL-1β的成熟與分泌作為啟動細(xì)胞內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),在調(diào)節(jié)AMI后心肌纖維化及重塑過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。雖然在AMI 28 d后, NLRP3炎性體激活與EndMT進(jìn)展具有同一性,其下游產(chǎn)物IL-1β又被證實(shí)參與了對End-MT調(diào)控因子的調(diào)節(jié),但兩者的相互作用方式仍有待進(jìn)一步證實(shí)。

        本實(shí)驗研究結(jié)果表明在AMI后心肌纖維化過程中,NLRP3炎性體-IL-1β信號軸激活與End-MT的上調(diào)同時發(fā)生,兩者之間的潛在作用將為AMI后HF的防治提供新靶點(diǎn)。

        Figure 2.AMI promoted End-MT. The protein expression of CD31, VE-cadherin, α-SMA and FSP1 was determined by Western blot. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.

        Figure 3.AMI activated NLRP3 inflammasome-IL-1β signaling axis. A: the results of Western blot for determining the protein expression of NLRP3, ASC, pro-caspase-1 and caspase-1; B: the level of IL-1β was measured by ELISA. Mean±SD. n=15. *P<0.05 vs sham group.

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