孫 瑞，何 丹，郝 雯，孫 秀，廖婉琳，周英順

(西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，四川瀘州 646000)

細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥問題日益嚴(yán)重，其耐藥水平及程度越來越高，已經(jīng)成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1-2]。產(chǎn)抗生素水解酶是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的主要原因[3]。而β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌產(chǎn)生的可水解青霉素類及頭孢類等多種抗生素的蛋白，尤其是產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectyum-β-lactamase，ESBLs）的細(xì)菌給臨床感染的診治造成嚴(yán)重挑戰(zhàn)[4]。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌仍然是臨床分離最高菌株（http://www.carss.cn/），產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌嚴(yán)重威脅到臨床感染的診[5]。研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院環(huán)境（污水、洗手間、門把手、醫(yī)療廢棄物）中耐藥菌可加速耐藥菌院內(nèi)感染，同時(shí)也促進(jìn)了耐藥菌的播散，加重了臨床感染治療的負(fù)擔(dān)[6-7]。因此開展醫(yī)院環(huán)境大腸桿菌及耐藥性的監(jiān)測及監(jiān)控，對院內(nèi)感染的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑及標(biāo)準(zhǔn)菌株

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、麥康凱瓊脂，LB固體培養(yǎng)基、LB營養(yǎng)瓊脂、M-H肉湯培養(yǎng)基等購自北京索萊寶科技有限公司；DNA 聚合酶 Ex Taq、Premix TaqTM、dNTP Mixture、DNA Marker、均購自TakaRa大連寶生物有限公司；瓊脂糖、核酸染料購自英濰捷基；引物合成及測序由上海生工技術(shù)有限公司完成。藥敏紙片購自溫州康泰生物技術(shù)有限公司。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922由西南醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室保存。

1.2 標(biāo)本采集及細(xì)菌分離鑒定

無菌棉簽采集四川省瀘州地區(qū)六家醫(yī)院的環(huán)境樣品包括病房地板、電梯按鈕、衛(wèi)生間水龍頭、病房門把手、換藥室、垃圾桶、空氣等標(biāo)本200份，均勻涂抹在麥康凱瓊脂平板，37℃過夜培養(yǎng)后，挑紅色單菌落于液體TSB培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)12 h，使用16s RNA通用引物27F和1429R PCR擴(kuò)增16s RNA基因，電泳檢測PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送上海生工有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定。所獲序列通過GenBank、Ez-Taxon6和LeBIBI數(shù)據(jù)庫鑒定菌種種屬關(guān)系。

1.3 藥敏表型測定

對通過16s RNA序列測定比對確定為大腸桿菌菌株進(jìn)行ESBLs確證實(shí)驗(yàn)，方法參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室委員會(huì)（CLSI-M100-S17）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。對ESBLs為陽性的菌株進(jìn)行氯霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、頭孢噻呋、氨芐西林、磺胺甲氧嘧啶、阿米卡星等抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)。按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室委員會(huì)標(biāo)（CLSI）推薦的K-B紙片法進(jìn)行。將所分離大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，生理鹽水稀釋到OD值為0.08～0.1之間，使用滅菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布于TSA培養(yǎng)基,將所選擇的藥敏紙片等距地貼在瓊脂平板表面。37℃過夜培養(yǎng)，游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小并按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。大腸桿菌ATCC25922作為陰性對照。

1.4 細(xì)菌耐藥基因檢測

挑ESBLs陽性菌株單菌落于TSB肉湯培養(yǎng)基震蕩過夜培養(yǎng)。參考分子克隆手冊采用煮沸法制備DNA模板。使用PCR方法擴(kuò)增磺胺類耐藥基因（sul1，sul2，sul3），氯霉素耐藥基因（cat，floR,cmlA,cfr），氟喹諾酮（qnrA,qnrB,qnrC,qnrD）類，氨基糖苷類耐藥基因[（rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,aac(6')-Ib,ant(3')-Ia）]，主要的ESBLs基因（blaCTX-M-1,blaCTX-M-2,blaC-TX-M-9,blaSHV,blaTEM），四環(huán)素耐藥基因（tetA,tetB,tetC），頭孢菌素耐藥基因（blaCMY和blaDHA）及主要整合子類型（Int1與Int2）進(jìn)行檢測，并對其進(jìn)行序列測定。引物（表1）由上海生工合成，所獲產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行序列測定[8]。

表1 所擴(kuò)增耐藥基因引物序列

b l a CTX-M-1[1 2]b l a CTX-M-2[1 2]b l a CTX-M-9[1 2]b l a SHV [1 2]b l a TEM [1 2]b l a CMY [1 3]b l a DHA [1 3]R m t A [1 4]R m t B [1 4]R m t C [1 4]a a c(6')-I b [1 5]a n t(3')-I a [1 5]t e t A [1 5]t e t B [1 6]t e t C [1 5]I n t 1[1 7]I n t 2[1 7]I n 1[1 7]I n 2 F:G G T T A A A A A A T C A C T G C G T C R:T T G G T G A C G A T T T T A G C C G C F:A T G A T G A C T C A G A G C A T T C G R:T G G G T T A C G A T T T T C G C C G C F:A T G G T G A C A A A G A G A G T G C A R:C C C T T C G G C G A T G A T T C T C F:A T T T G T C G C T T C T T T A C T C G C R:T T T A T G G C G T T A C C T T T G A C C F:A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T G R:T T A C C A A T G C T T A A T C A G T G A G F:T G G C C A G A A C T G A C A G G C A A A R:T T T C T C C T G A A C G T G G C T G G C F:A A C T T T C A C A G G T G T G C T G G G T R:C C G T A C G C A T A C T G G C T T T G C F:C C C G T G A G A T T G T T G C T G R:T G T C T G G T C T T G C G T T T C F:T T T C T G C G G G C G A T G T A A R:A G T T C T G T T C C G A T G G T C T T T F:G A A G A A G T A A C A G C C A A A G R:A T G C C A G C C T C C G T A A A F:A T G A C C T T G C G A T G C T C T A T G R:C G A A T G C C T G G C G T G T T T F:A T C T G G C T A T C T T G C T G A C A R:T A T G A C G G G C T G A T A C T G G F:G G C A C C G A A T G C G T A T G A T R:A A G C G A G C G G G T T G A G A G F:T T G G T T A G G G G C A A G T T T T G R:G T A A T G G G C C A A T A A C A C C G F:C T G G G C T G C T T C C T A A T G C R:A G C T G T C C C T G A T G G T C G T F:T C T C G G G T A A C A T C A A G G 2 4 3 R:G T T C T T C T A C G G C A A G G T F:C A C G G A T A T G C G A C A A A A A G G T 2 3 3 R:G T A G C A A A C G A G T G A C G A A A T G F:A A G C A G A C T T G A C C T G A R:G G C A T C C A A G C A A G F:C G G G A T C C C G G A C G G C A T G C A C G A T T T G T A R:G A T G C C A T C G C A A G T A C G A G[1 7]

2 結(jié)果

2.1 菌株分離鑒定及藥敏結(jié)果

從瀘州地區(qū)6家醫(yī)院所采取的200份標(biāo)本中，分離到大腸桿菌51株，通過藥敏表型和ESBLs確證實(shí)驗(yàn)，其中24株為ESBLs陽性菌株。24株菌對氯霉素、四環(huán)素和磺胺類耐藥率為100%，對氟喹諾酮類耐藥率為87.5%，對氨基糖苷類耐藥率為54.1%。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸桿菌耐藥基因檢測

耐藥基因詳細(xì)結(jié)果見表2，發(fā)現(xiàn)這24株ESBLs陽性菌，其中blaCTX-M陽性率為19/24（圖1），對其序列測定分析發(fā)現(xiàn)其中blaCTX-M-14陽性率為6/24，blaC-TX-M-15陽性率為5/24，blaCTX-M-27陽性率為3/24，blaCTX-M-3陽性率為4/24，blaCTX-M-24陽性率為1/24，blaSHV陽性率為17/24，其中 blaSHV-11陽性率為 3/24，blaSHV-12陽性率為7/24，blaSHV-38陽性率為2/24，blaSHV-2a陽性率為3/24，blaSHV-28陽性率為 1/24，blaSHV-26陽性率為 1/24。blaTEM-1陽性率為7/24，頭孢菌素耐藥基因blaDHA與blaCMY陽性率分別為3/24和1/24。磺胺類耐藥基因（sul1與sul2）陽性率分別為11/24和3/24，四環(huán)素耐藥基因（tetA與tetB）陽性率分別為10/24與1/24。氯霉素耐藥基因（floR，cmlA）陽性率分別為5/24與3/24。氟喹諾酮類耐藥基因（qnrB，qnrS）陽性率為9/24，2/24。氨基糖苷類耐藥基因（rmtA，rmtB，aac(6')-Ib,ant(3')-Ia）陽性率分別為1/24、2/24、6/24、1/24。詳細(xì)結(jié)果見表2，本研究中檢測出1型整合子10個(gè)，其中有一個(gè)菌同時(shí)攜帶I型和II型整合子。其中dfrA17-aadA5和dfrA12-orfF-aadA2結(jié)構(gòu)基因盒菌株均為4株，含有dfrA1-orfC，dfrA1-sat2-aadA1和dfrA17基因盒菌株。

圖1 19個(gè)blaCTX-M耐藥基因電泳圖

3 討 論

多重耐藥大腸桿菌分離率依然高居不下,給臨床細(xì)菌性疾病感染的診治造成嚴(yán)重挑戰(zhàn)（http://www.carss.cn/）[18]。研究表明，醫(yī)院環(huán)境（空氣、污水、門把手等）中存在著大量的耐藥菌，也可導(dǎo)致院內(nèi)感染，促進(jìn)了耐藥基因的播散，給耐藥的防治帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)。本研究從瀘州地區(qū)6家醫(yī)院環(huán)境中分離到51株大腸桿菌，其中ESBLs陽性菌為24株，其對氯霉素、四環(huán)素和磺胺類耐藥率為100%，對氟喹諾酮類耐藥率為87.5%，對氨基糖苷類耐藥率為54.1%。表明醫(yī)院環(huán)境中ESBLs大腸桿菌陽性率較高，且對其他抗生素耐藥率較高，說明需要加強(qiáng)對醫(yī)院環(huán)境中細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測和監(jiān)控[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，24株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中，ESBLs耐藥基因blaCTX-M和blaSHV陽性率分別為19/24和17/24，且存在著多種亞型，如本研究發(fā)現(xiàn)blaCTX-M陽性率為19/24，其中主要存在著blaCTX-M-14，blaCTX-M-15，blaCTX-M-27，blaCTX-M-3，blaCTX-M-24等五種 亞 型 ，同 時(shí) 存 在 著 blaSHV-11，blaSHV-12，blaSHV-38，blaSHV-2a，blaSHV-28，blaSHV-26。表明醫(yī)院環(huán)境中 ESBLs基因類型存在多樣性，需警惕新亞型的出現(xiàn)。24株ESBLs陽性菌，除了攜帶有ESBLs基因，同時(shí)攜帶有其他抗生素水解基因，如磺胺類、氯霉素、四環(huán)素、氨基糖苷類及氟喹諾酮類抗生素耐藥基因。表明24株ESBLs菌均為多重耐藥菌。此外，從24株ESBLs陽性菌中檢測出I型整合子有10個(gè)，且存在同時(shí)攜帶I型和II型整合子的菌株。整合子菌株基因結(jié)構(gòu)以dfrA17-aadA5和dfrA12-orfF-aadA2為主。整合子是耐藥菌株水平傳播的重要方式，可能促進(jìn)了耐藥基因的傳播。

4 結(jié) 論

瀘州地區(qū)醫(yī)院環(huán)境中產(chǎn)ESBLs大腸桿菌耐藥水平較高，主要攜帶有blaCTX-M-14和blaSHV12等ESBLs耐藥基因，且存在著多種亞型，同時(shí)攜帶有耐四環(huán)素、氯霉素、氨基糖苷類及氟喹諾酮類耐藥基因。因此，需警惕醫(yī)院環(huán)境中耐藥菌傳播。