李婷婷,李 楨,杜 淼,邢亞楠,董煥聲,潘慶杰
(青島農業(yè)大學動物科技學院,山東青島 2661091)
綿羊是第1個被馴化的放牧動物,可以給人們提供肉、皮、奶、毛等主要生產和生活材料,發(fā)展綿羊產業(yè)能夠有效提高畜牧業(yè)經濟效益[1]。除少部分綿羊品種常年發(fā)情外,大多數品種為季節(jié)性發(fā)情,不能全年進行配種,這在一定程度上影響了羊的繁殖效率,因此提升綿羊單產能力對生產效率有至關重要的影響[2]。由于綿羊高繁殖力的遺傳力較低,致使其育種進程非常緩慢[3-4]。湖羊是我國選育出的高繁殖力綿羊品種之一。湖羊源于北方的蒙古羊[5-6],具有性成熟早、繁殖率高、繁殖周期短、早期生長快等優(yōu)點,母羊的平均產羔率可達到256%,有的甚至可達300%以上,是世界上較稀少的具有高繁殖力的綿羊品種之一。相比湖羊而言,杜泊羊的繁殖力比較低,但杜泊羊胴體肉質好,生長發(fā)育速度較快,體重在100日齡時可以達到30~35 kg。在繁殖力方面,初產的杜泊母羊和經產的杜泊母羊繁殖率分別為135.13%和144.44%[7]。研究表明,ADPN(脂聯素)基因及PTGS2(前列腺內過氧化物合酶2)基因是影響繁殖性狀的2個主要候選基因[8-9]。本實驗以湖羊和杜泊羊為研究對象,采用直接測序法對ADPN基因和PTGS2基因進行多態(tài)性檢測,深入分析基因突變與繁殖力的關系,為進一步完善基因選育在綿羊生產中的應用、提高羊繁殖能力提供理論基礎和實踐依據。
1.1 實驗動物及采樣方法 實驗選擇有1~3胎的產羔記錄、身體健康的65只湖羊和60只杜泊羊,在山東省朝陽畜牧有限公司同一飼喂條件下自由采食和飲水。在每只羊的耳緣部用75%酒精棉球消毒后,用耳標鉗取耳組織1~2 cm,置于盛有無水乙醇的1.5 mL的離心管中,并在每個離心管上標上耳號,放入液氮中帶回實驗室,-80 保存。
1.2 主要耗材、試劑 細胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供;DNA Marker、6×Loading Buffer、Premix Taq均購自 TaKaRa公司;核酸染料購自上海生工生物工程公司;無水乙醇,50×TAE緩沖液,瓊脂糖。
1.3 基因組DNA的提取 采用細胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒進行湖羊和杜泊羊的耳組織基因組DNA的提取。
1.4 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳 利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的純度,核酸分析儀測定DNA濃度,DNA OD260/OD280均在1.7~1.9。
1.5 引物設計及PCR擴增與檢測 以牛ADPN基因序列為參照[10],使用Primmer5.0設計ADPN基因引物,擴增ADPN基因第3外顯子部分序列;根據Gladney等[11]提供的牛第3外顯子到第5外顯子的引物作為羊的PTGS2基因引物。引物均由上海生工生物工程公司合成,引物序列見表1。
1.6 PCR擴增體系的建立 PCR擴增體系25 μL:上、下游引物各 1 μL;DNA 模板 1 μL;Premix Taq酶 12.5 μL;超純水 9.5 μL。ADPN基因引物的最佳PCR反應程序:95 預變性3 min,95 變性30 s,55 退火30 s,72 延伸1 min,35個循環(huán),72 延伸10 min,4 保存。PTGS2基因引物的最佳PCR反應程序:95 預變性3 min,95 變性30 s,53 退火30 s,72 延伸1 min,35個循環(huán),72 延伸10 min,4保存。產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
1.7 PCR產物的切膠回收 使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行PCR擴增產物切膠回收純化,DNA溶液直接送去測序。
對ADPN、PTGS2基因進行PCR擴增切膠直接測序,對測得的序列用Megalign軟件進行序列比對,并用Blast軟件與NCBⅠ上的原始序列進行比對。
1.8 統(tǒng)計分析 運用Excel 2010 軟件統(tǒng)計各綿羊ADPN、PTGS2基因位點的突變數、基因型及產羔數,數據以平均值±標準誤表示。用SPSS 22.0 軟件中一般線性模型完成湖羊、杜泊羊基因型與產羔表型數據關聯分析。
2.1 基因組DNA提取結果 從圖1中可以看到,條帶清晰,亮度較高,無拖尾現象,說明基因組DNA純度比較好,提取過程沒有蛋白質污染,沒有DNA降解,所提取的DNA符合后續(xù)的PCR擴增要求。
圖1 湖羊和杜泊羊DNA檢測結果
2.2 PCR擴增產物的檢測 如圖2顯示,湖羊和杜泊羊ADPN基因引物和PTGS2基因引物PCR產物的目的條帶明亮并且整齊一致,擴增片段的大小正確,特異性較好,可以用來進行后續(xù)實驗。ADPN、PTGS2基因的目的片段分別是659、1 600 bp。
2.3 基因純化 除去PCR產物中的蛋白質及其他有機化合物、無機鹽離子、寡核苷酸引物等雜質,提純后的PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,可以用來直接測序(圖3)。
2.4 突變位點的檢測
2.4.1ADPN基因堿基突變的檢測 如圖4~7所示(為保證突變清洗,截取部分序列長度),ADPN基因在133 bp處發(fā)生G→A的突變,該位點的密碼子由GAT轉變成AAT,并使編碼的氨基酸由D(天冬氨酸)轉變成N(天冬酰胺);在594 bp處也發(fā)生G→A的突變,該位點的密碼子由AGA轉變?yōu)锳AA,編碼的氨基酸由R(精氨酸)轉變?yōu)镵(賴氨酸)。
表1 引物序列
圖2 ADPN、PTGS2基因PCR檢測結果
圖3 ADPN 、PTGS2基因純化結果
圖4 ADPN基因在133 bp處的堿基突變
圖5 ADPN基因133bp處的峰圖
圖6 ADPN基因在594 bp處的堿基突變
圖7 ADPN基因594 bp處的峰圖
2.4.2PTGS2基因堿基突變的檢測 如圖8、9所示,PTGS2基因在77 bp處發(fā)生遺傳變異,該位點的密碼子由AAA轉變?yōu)镃AA,并使編碼的氨基酸由K(賴氨酸)轉變?yōu)镼(谷氨酰胺)。
圖8 PTGS2基因在77 bp的堿基突變
圖9 PTGS2基因77 bp處的峰圖
2.5 基因突變對產羔數的影響 湖羊1年產羔羊2次或者2年產羔羊3次,母羊平均的產羔率可達256%;與湖羊相比,杜泊羊的平均產羔率為140%。如表2顯示,湖羊ADPN、PTGS2基因突變數均極顯著高于杜泊羊(P<0.01);湖羊平均產羔數極顯著高于杜泊羊(P<0.01)。
表2 基因突變對產羔數的影響
2.6 相關性分析 由表3可以看出,ADPN基因和PTGS2基因的突變與產羔數呈現極顯著相關(P<0.01),說明相關系數的值不是偶然因素造成的;而ADPN基因和PTGS2基因Pearson相關系數值都大于0,說明這2個基因的突變與產羔數之間存在高度的線性正相關。
表3 ADPN、PTGS2基因與產羔數的相關性(n=125)
ADPN基因在生殖過程中通過不同水平表達來調控下丘腦和垂體、卵巢或者直接作用卵母細胞和胚胎以及雄性睪丸等。劉重旭等[12]在研究中國西南9個山羊品種發(fā)現,3′UTR區(qū)發(fā)生G→A突變,在不同的山羊品種中等位基因的頻率不相同。本研究在ADPN基因外顯子3共檢測到2個突變。楊彥杰等[13]對于牛的研究顯示,ADPN基因外顯子上檢測到1個突變位點,由于牛、羊在生物分類學上歸入偶蹄目牛科,均為反芻類食草動物,由此說明牛和羊在進化進程中雖然共祖,但又產生了基因遺傳的差異性。本研究在內含子上沒有發(fā)現堿基突變,這與曹海洋[10]在小尾寒羊上檢測到內含子中4個突變不相符,可能是綿羊品種間存在個體差異性。
Liu等[14]和Sirois[15]研究發(fā)現,PTGS2的表達調控決定著反芻類食草動物排卵進程的長短。研究發(fā)現,PTGS2基因缺陷型的小鼠卵泡正常發(fā)育,但因黃體缺乏而導致不能正常排卵[16]。Linville等[17]發(fā)現,將野生型胚泡植入到PTGS2缺陷型小鼠子宮內,往往不能發(fā)育,進一步證實了PTGS2基因對蛻膜的重要性。本實驗在湖羊的堿基序列上檢測到1處突變位點,這與梁瑞圓等[18]發(fā)現小尾寒羊上PTGS2基因擴增片段中均存在堿基突變的結果一致。
與杜泊羊相比,湖羊高繁殖力的特征較為顯著。在本研究中,高繁殖力的湖羊群體在ADPN基因和PTGS2基因都有突變位點,而在杜泊羊群體中沒有發(fā)現突變位點。湖羊在ADPN基因133 bp處發(fā)生G→A突變,并使編碼的氨基酸由D(天冬氨酸)轉變成N(天冬酰胺);在594 bp處也發(fā)生了G→A突變,編碼的氨基酸由R(精氨酸)轉變?yōu)镵(賴氨酸)。在PTGS2基因77 bp處發(fā)生了A→C突變,并使編碼的氨基酸由K(賴氨酸)轉變?yōu)镼(谷氨酰胺)。同時,通過相關性分析發(fā)現,基因的突變率與產羔數呈顯著相關,研究結果證明ADPN基因與PTGS2基因參與調控綿羊的繁殖效率。
本研究發(fā)現,ADPN基因與PTGS2基因突變與產羔數呈顯著相關,進一步分析發(fā)現2個基因是影響湖羊高繁殖力的基因,可以作為高繁多胎性狀的候選基因。