劉 輝， 袁俊杰， 傅小進(jìn)， 陳析豐， 馬伯軍

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004；2.浙江師范大學(xué) 圖文信息中心,浙江 金華 321004)

植物類病變(lesion mimic)是一類在沒(méi)有病原物入侵時(shí)就能產(chǎn)生類似病變的壞死斑(lesion)的現(xiàn)象[1]，其表型與植物抗病應(yīng)答的超敏反應(yīng)(hypersensitive reaction)非常相似，在抗病分子機(jī)理研究中受到廣泛關(guān)注.有趣的是，植物類病變的表型雖然不依賴于病原物的入侵，但是卻受光照、溫度[2]或濕度[3]等外界環(huán)境因子的影響.尤其是光照，許多類病變的發(fā)生都需要光的誘導(dǎo)，如擬南芥突變體lsd1[4],mips1[5]和cat2[6]等的類病變都受光誘導(dǎo)，水稻spl7[7],lmi[8]和玉米les23[9]等突變體光照后出現(xiàn)類病斑，葉片遮光處理后則無(wú)類病斑.王建軍等[10]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),水稻突變體lrd32和lrd40在所有單色光源下均產(chǎn)生類病斑，而lrd31,lrd36,lrd35與lrd37的類病斑則分別受紫外、黃光、藍(lán)光誘導(dǎo).這些研究說(shuō)明光是誘發(fā)類病變的重要因子，但是具體的作用機(jī)理目前尚未明確.水稻類病變spl5(spottedleaf5)是γ射線輻射誘導(dǎo)突變體，本實(shí)驗(yàn)室克隆了水稻spl5基因[11-12]，并發(fā)現(xiàn)其類病變的形成受光照誘導(dǎo).本文對(duì)光誘導(dǎo)spl5突變體產(chǎn)生類病變的原因進(jìn)行了研究，初步闡明了spl5類病變受光誘導(dǎo)的機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 水稻材料及種植

5月初，取水稻spl5突變體及其野生型近等基因系浙輻802(OryzasativaL.ssp.Indica)的種子，浸水37 ℃,催芽2 d，撒播苗床，6月初移栽大田，進(jìn)行常規(guī)水稻種植管理.播種60 d后，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理與取樣.

1.2 葉片遮光與濾光處理

選取spl5用突變體植株完全展開且未出現(xiàn)類病斑的葉片，進(jìn)行遮光和濾光處理.用錫箔紙遮光包住葉片一部分進(jìn)行黑暗遮光處理；用2片相同的濾光片夾住葉片一部分進(jìn)行濾光處理，采用的濾光片及其通過(guò)波長(zhǎng)分別為：紫外光(200～400 nm)、藍(lán)光(350～550 nm)、綠光(500～650 nm)、紅光(620～700 nm)與紅外光(>680 nm).7 d后，待葉片未遮光或?yàn)V光部位出現(xiàn)類病斑后，取下錫箔紙和濾光片，觀察葉片遮光或?yàn)V光處類病斑發(fā)生情況.實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次.

1.3 葉綠體結(jié)構(gòu)的電鏡觀察

用刀片將水稻葉片切成1 mm×1 mm的小塊，用2.5%戊二醛4 ℃固定24 h以上.樣品用0.1 mol/L(pH 7.0)磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min，再用1.0%鋨酸溶液固定樣品5 h，0.1 mol/L(pH 7.0)磷酸緩沖液漂洗3次，每次15 min.樣品經(jīng)不同濃度梯度的乙醇脫水后，用環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋.樣品在LEICA EM UC7型超薄切片機(jī)中切片，獲得60～80 nm的切片，切片經(jīng)2.0%醋酸鈾飽和水溶液、枸櫞酸鉛各染色15 min，晾干后，在Hitachi HT-7700型透射電鏡中觀察葉綠體結(jié)構(gòu).

1.4 葉綠素與類胡蘿卜素的含量測(cè)定

按照Porra等[13]方法,用80%丙酮提取光合色素，用分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素的含量.測(cè)定時(shí)，分別選取長(zhǎng)勢(shì)一致的6株spl5突變體與6株野生型對(duì)照，每株上取1片同一位置且完全展開的葉片，分別測(cè)定葉綠素含量，并進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析突變體與野生型之間的顯著性差異.

1.5 H2O2組織化學(xué)染色

采用二氨基聯(lián)苯胺(diamino benzidine，DAB)染色法[14]：取水稻葉片，浸泡在1 mg/ml DAB溶液(pH 3.8)中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中光照8 h，取出葉片置于96%乙醇溶液中，沸水浴中脫色10 min，將葉片在新的96%乙醇中25 ℃浸泡4 h，觀察葉片中是否出現(xiàn)紅褐色斑點(diǎn).

2 結(jié)果與分析

2.1 光促進(jìn)spl5突變體的類病變發(fā)生

在自然光照下，水稻spl5突變體葉片上會(huì)產(chǎn)生棕褐色類病斑.用鋁箔紙將spl5突變體上未出現(xiàn)類病斑的葉片進(jìn)行局部黑暗遮光處理1周，未遮光部位出現(xiàn)明顯的類病斑，而遮光部位則沒(méi)有類病斑(見(jiàn)圖1)，表明光照可以促進(jìn)spl5突變體類病變的發(fā)生.為了進(jìn)一步研究不同波長(zhǎng)的光對(duì)spl5突變體類病斑產(chǎn)生的影響，筆者將鋁箔紙分別換成不同濾光片，分別是只能被紫外光、藍(lán)光、綠光、紅光、紅外光透過(guò)，從短波到長(zhǎng)波，覆蓋了整個(gè)光波段的濾光片.對(duì)spl5突變體上未出現(xiàn)類病斑的葉片進(jìn)行濾光處理，發(fā)現(xiàn)紫外光、藍(lán)光和紅光透過(guò)的部位出現(xiàn)類病斑，而綠光和紅外光透過(guò)的部位則沒(méi)有出現(xiàn)類病斑.這說(shuō)明，紫外光、藍(lán)光和紅光是誘發(fā)spl5突變體類病變的重要因子.

直線標(biāo)注區(qū)域?yàn)槿~片的遮光或?yàn)V光部位;箭頭指明類病斑情況 圖1 經(jīng)遮光或?yàn)V光處理的spl5突變體葉片及類病斑情況

2.2 spl5突變體的葉綠體發(fā)育異常

在植物光合作用中，紅、藍(lán)光是葉綠體吸收的主要光波.因此，筆者選取野生型葉片組織與spl5突變體上沒(méi)有出現(xiàn)類病變的葉片組織，分別進(jìn)行葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)的比較觀察.與野生型相比，在spl5突變體葉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)葉綠體數(shù)目偏少，類囊體片層結(jié)構(gòu)不明顯，甚至扭曲(見(jiàn)圖2).同時(shí)，光合色素含量的測(cè)定也表明，spl5突變體葉片的葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素的含量都顯著低于野生型對(duì)照WT(見(jiàn)圖3).這些結(jié)果都表明，spl5突變體葉片中的葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，葉綠素含量下降.

a:葉細(xì)胞野生型對(duì)照；b:葉細(xì)胞 spl5突變體；c:葉綠體野生型對(duì)照；d:葉綠體spl5突變體

2.3 光誘發(fā)spl5突變體中H2O2過(guò)量積累

葉綠體是植物體中活性氧產(chǎn)生的重要細(xì)胞器，而活性氧的過(guò)量積累能引起細(xì)胞壞死.通過(guò)對(duì)活性氧H2O2的組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，野生型葉片在光照下沒(méi)有發(fā)生H2O2的積累；而spl5突變體葉片在光照下則發(fā)生大量的H2O2積累(褐色染色斑)，但是經(jīng)黑暗遮光處理的部位卻沒(méi)有發(fā)生H2O2的積累(見(jiàn)圖4)，說(shuō)明光可以導(dǎo)致spl5突變體積累過(guò)量的H2O2.

圖3 spl5突變體葉片的光合色素含量

圖4spl5突變體葉片的DAB染色情況

3 討論

目前研究表明，光照是誘導(dǎo)植物類病變發(fā)生的一個(gè)重要因素[7-9]，但是其具體的機(jī)理并不清楚.據(jù)報(bào)道，水稻突變體lrd32和lrd40在所有單色光源下均產(chǎn)生類病斑，而lrd31,lrd36,lrd35與lrd37的類病斑則分別受紫外光、黃光、藍(lán)光誘導(dǎo)，說(shuō)明不同水稻類病變受光誘導(dǎo)的機(jī)理并不完全相同[10].本研究發(fā)現(xiàn)，紫外光、藍(lán)光和紅光均能夠誘發(fā)水稻spl5突變體產(chǎn)生類病變，而綠光和紅外光則不能.藍(lán)光和紅光是植物進(jìn)行光合作用時(shí)葉綠體吸收最主要的2種光，而綠光和紅外光則被葉片反射，幾乎不被吸收利用.葉綠體通過(guò)吸收藍(lán)光和紅光的能量，將氧氣作為光激發(fā)產(chǎn)生的電子受體，通過(guò)Mehler反應(yīng)排散多余的能量，產(chǎn)生超氧陰離子、H2O2、羥自由基和單線氧等活性氧[15].高濃度活性氧對(duì)細(xì)胞有很強(qiáng)的毒害作用，但是葉綠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)保持活性氧產(chǎn)生和降解的平衡，不會(huì)影響植物的正常生理功能.一旦葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，很可能導(dǎo)致活性氧的過(guò)量積累，從而引發(fā)細(xì)胞壞死.筆者研究發(fā)現(xiàn)，在spl5突變體沒(méi)有發(fā)生類病變的葉片組織中，其葉綠體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，光合色素含量顯著下降，并且光可以誘發(fā)spl5突變體葉片積累過(guò)量的活性氧.因此推測(cè)，spl5突變體的葉綠體發(fā)育異常，在光照下葉綠體不能進(jìn)行正常的光能轉(zhuǎn)化和電子傳遞時(shí)產(chǎn)生大量活性氧，引發(fā)細(xì)胞壞死，出現(xiàn)類病斑表型.

筆者還發(fā)現(xiàn)，紅光誘發(fā)spl5突變體的類病變比藍(lán)光更加明顯.這可能有2個(gè)原因：一是葉綠體吸收最多的是紅光，而藍(lán)光其次；二是紅光波長(zhǎng)比藍(lán)光長(zhǎng)，葉綠體吸收相同能量的光時(shí)，紅光能使更多的色素分子成為激發(fā)態(tài)，釋放更多的能量.無(wú)論是葉綠體吸收更多紅光，還是紅光可以釋放更多的能量，其結(jié)果都有可能使spl5突變體產(chǎn)生比吸收藍(lán)光更多的活性氧，從而促進(jìn)細(xì)胞的壞死.此外，紫外雖然不是光合作用的主要光源，但是紫外光能夠使水稻葉片活性氧代謝紊亂和膜損傷[16]，導(dǎo)致spl5突變產(chǎn)生類病斑.

spl5基因編碼水稻剪接因子SF3b的亞基SF3b3，推測(cè)spl5基因突變可能影響了一些葉綠體發(fā)育或光系統(tǒng)相關(guān)基因mRNA的正常剪接，從而導(dǎo)致其葉綠體發(fā)育異常.擬南芥突變體lsd1的類病變可以被光捕獲蛋白突變基因cao所抑制[4]，而玉米突變體lls1的類病變也可被光能捕獲蛋白突變基因ij1所抑制[17].可見(jiàn)，植物類病變的發(fā)生與光合系統(tǒng)有重要的關(guān)系，但是其具體的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入的研究.