姚陳霞， 劉亞飛， 黃金龍， 阮永明

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004；2.云南森美達(dá)生物科技有限公司,云南 楚雄 675100)

松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol)廣泛存在于多種植物精油中，且是大多數(shù)植物精油的主要成分.目前發(fā)現(xiàn)水蒸氣提取物中含有松油烯-4-醇成分的植物已有80余種，其中從柏科、菊科、姜科和唇形科等植物提取的精油中，松油烯-4-醇所占比例非常高.Kaul等[1]發(fā)現(xiàn)從菊蒿(Tanacetumlongifolium)根部提取的黃色精油中主要成分為松油烯-4-醇，占總成分的25.8%，Bordoloi等[2]通過水蒸氣蒸餾法使卡薩蒙納姜(Zingibercassumunar)根中所含成分分離出來，發(fā)現(xiàn)其松油烯-4-醇的含量為50.5%.

國內(nèi)外關(guān)于松油烯-4-醇對衛(wèi)生害蟲和農(nóng)業(yè)害蟲的作用研究有很多.如 Cowles 等[3]發(fā)現(xiàn)松油烯-4-醇對蔥蠅(Deliaantigua)等昆蟲有忌避作用，而且對不同種類的昆蟲具有明顯的觸殺和熏蒸毒力.Tighe等[4]發(fā)現(xiàn)松油烯-4-醇對蠕形螨(DemodexfolliculorumandD.brevis)生物活性具有強(qiáng)烈的抑制作用，是導(dǎo)致其死亡的主要原因.陳根強(qiáng)等[5]發(fā)現(xiàn)松油烯-4-醇對不同昆蟲如家蠅(Muscadomestica)、玉米象(Sitophiluszeamais)、粘蟲(Mythimnaseparata)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)的熏蒸毒力有所差別，對鱗翅目昆蟲的熏蒸毒力更為明顯.松油烯-4-醇作用于供試?yán)ハx后，試蟲一般都依次表現(xiàn)為興奮、痙攣、麻痹和死亡4個階段.一般認(rèn)為，比較快的中毒死亡大部分都是由于藥物直接作用于神經(jīng)系統(tǒng).松油烯-4-醇作用于供試?yán)ハx后，供試?yán)ハx表現(xiàn)出的中毒癥狀與六六六、環(huán)戊二烯類等藥劑作用于昆蟲后的中毒癥狀非常相似，都具有典型的神經(jīng)毒劑特征[6].

陳根強(qiáng)等[7]觀察了松油烯-4-醇對粘蟲幼蟲體壁結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)松油烯-4-醇熏蒸處理會導(dǎo)致粘蟲體表的蠟質(zhì)層顆粒溶解，并對氣門和體壁有不同程度的破壞.馬志卿等[8-10]測定了松油烯-4-醇對粘蟲體內(nèi)幾種酶的影響，研究表明，松油烯-4-醇可以激活血淋巴酯酶、超氧化物歧化酶和磷酸酶，而抑制了Na+,K+-ATP酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶的活性；馬志卿等[11-12]發(fā)現(xiàn)松油烯-4-醇主要是通過抑制昆蟲體內(nèi)Na+,K+-ATP酶的活性使昆蟲中毒乃至死亡，供試?yán)ハx體內(nèi)Na+,K+-ATP酶活性被抑制后，導(dǎo)致Na+,K+和Ca2+等離子的運(yùn)輸出現(xiàn)混亂，并釋放一些神經(jīng)遞質(zhì)使機(jī)體出現(xiàn)中毒癥狀.陳根強(qiáng)[13]發(fā)現(xiàn)松油烯-4-醇主要是通過干擾Na+通道的正常開閉來抑制Na+,K+-ATP酶活性，從而使神經(jīng)傳導(dǎo)紊亂然后發(fā)生一系列中毒反應(yīng)，抑制的同時還伴有試蟲大量失水并引起血淋巴理化性質(zhì)的改變.為進(jìn)一步探索松油烯-4-醇的殺蟲機(jī)理、研發(fā)新型生物農(nóng)藥做好基礎(chǔ)研究，本實(shí)驗(yàn)測定了松油烯-4-醇對蚜蟲的熏蒸和觸殺毒力，并進(jìn)一步測定了其對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 主要試劑

松油烯-4-醇(純度99%，由云南森美達(dá)生物科技有限公司提供)；ATP酶測試盒(購自南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)公司).

1.1.2 供試?yán)ハx

蠶豆蚜(Aphiscraccivora)：室內(nèi)長期以蠶豆苗飼養(yǎng)(溫度：(25±1) ℃；濕度：70%～80%；光照/黑暗：16 h/8 h)的敏感種群，挑選個體大小發(fā)育一致、活性良好的無翅成蚜供試.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熏蒸毒力測定

松油烯-4-醇對蠶豆蚜蟲的熏蒸毒力測定用錐形瓶熏蒸法[14].把大小一致的無翅成蚜接入錐形瓶(V=300 mL)中，瓶塞中央插入大頭針，把長為4 cm、寬為2 cm的濾紙條固定在大頭針頂端，懸掛在瓶口上.用丙酮作為溶劑把松油烯-4-醇稀釋至10，20，40和80倍，用移液器分別向?yàn)V紙條上滴加一定量不同稀釋倍數(shù)的試劑，對照組滴加等量丙酮，滴加之后快速蓋上瓶塞.每種試劑分別處理50頭蚜蟲并重復(fù)3次.根據(jù)錐形瓶體積和滴加試劑的體積可算出不同稀釋倍數(shù)下松油烯-4-醇的濃度.只滴加松油烯-4-醇時，所含松油烯-4-醇的濃度為69.975 0 mg/L；將松油烯-4-醇稀釋至10，20，40和80倍時，所含松油烯-4-醇的濃度為6.997 5，3.498 7，1.749 3和0.874 6 mg/L.將錐形瓶置于養(yǎng)蟲室，8 h后檢查死亡的蚜蟲數(shù)，統(tǒng)計出死亡率及校正死亡率，然后用概率值分析法和Excel表格求得毒力回歸方程，并用SPSS統(tǒng)計分析軟件對方程進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，求出8 h的致死中量(LC50)和95%置信區(qū)間[15].

1.2.2 觸殺毒力測定

用丙酮作為溶劑把松油烯-4-醇稀釋至10，20，40和80倍，用移液器點(diǎn)滴0.5 μL到蚜蟲的前胸背板，每種試劑分別處理50頭蚜蟲并重復(fù)3次.對照組點(diǎn)滴等量的丙酮[16].根據(jù)丙酮和松油烯-4-醇的密度可求出不同稀釋倍數(shù)下松油烯-4-醇的施藥量.只滴加松油烯-4-醇時，其每頭施藥量為466.500 0 μg；將松油烯-4-醇稀釋至10，20，40和80倍時，每頭松油烯-4-醇的施藥量為46.650 0，23.325 0，11.662 5和5.831 2 μg.8 h后檢查死亡的蚜蟲數(shù)，統(tǒng)計出死亡率及校正死亡率，然后用概率值分析法和Excel表格求得毒力回歸方程，并用SPSS統(tǒng)計分析軟件對方程進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，求出8 h的致死中量(LD50)和95%置信區(qū)間[15].

1.2.3 酶活力測定方法

將經(jīng)過熏蒸和觸殺處理的無翅成蚜分別進(jìn)行Na+,K+-ATP酶活性測定.將經(jīng)過試劑處理的無翅成蚜，加入2 ml預(yù)冷的0.01 mol/L Tris-Hcl(pH 7.0)，冰浴研磨，然后高速離心(10 000 r/min)15 min，取上清液進(jìn)行蛋白濃度測定和 Na+,K+-ATP酶活性測定[17].

Na+,K+-ATP活性測定參照Na+,K+-ATP酶試劑盒說明書進(jìn)行.蛋白含量的測定參照BCA測試盒說明書進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 熏蒸毒力測定結(jié)果

松油烯-4-醇對蚜蟲的熏蒸毒力結(jié)果見表1.松油烯-4-醇對蚜蟲有顯著的熏殺作用，且隨著濃度的增加，熏殺效果越強(qiáng).根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)計算出松油烯-4-醇對蚜蟲的毒力回歸線，結(jié)果見表2.

表1 松油烯-4-醇對蚜蟲的熏蒸毒力測定結(jié)果(8 h)

表2 松油烯-4-醇對蚜蟲的熏蒸毒力回歸線(8 h)

2.2 觸殺毒力測定結(jié)果

松油烯-4-醇對蚜蟲的觸殺毒力結(jié)果見表3.松油烯-4-醇對蚜蟲有顯著的觸殺作用，且隨著濃度的增加，觸殺效果越強(qiáng).根據(jù)表3中數(shù)據(jù)計算得出松油烯-4-醇對蚜蟲的觸殺毒力回歸線，結(jié)果見表4.

表3 松油烯-4-醇對蚜蟲的觸殺毒力測定結(jié)果(8 h)

表4 松油烯-4-醇對蚜蟲的觸殺毒力回歸線(8 h)

2.3 Na+,K+-ATP酶活性測定結(jié)果

2.3.1 熏蒸處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響

熏蒸處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響見表5.測定結(jié)果表明，經(jīng)過熏蒸處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性具有顯著的抑制作用，且隨著松油烯-4-醇濃度的增加，抑制作用越強(qiáng).

表5 松油烯-4-醇熏蒸對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響

注：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.019 6x+0.088 8,R2=0.999 2.

2.3.2 觸殺處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響

觸殺處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶的活性的影響見表6.測定結(jié)果表明，經(jīng)過觸殺處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性具有顯著的抑制作用，且隨著松油烯-4-醇濃度的增加，抑制作用越強(qiáng).從表5和表6可知，松油烯-4-醇稀釋后，觸殺對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的抑制均高于熏蒸；而松油烯-4-醇直接作用于蚜蟲時，觸殺和熏蒸對Na+,K+-ATP酶活性的抑制作用幾乎相同.

表6 松油烯-4-醇觸殺對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響

注：標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.023 6x+0.091 4,R2=0.995 9.

3 討論

神經(jīng)毒劑殺蟲劑一般作用于害蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，影響害蟲神經(jīng)的傳導(dǎo)，來達(dá)到殺死害蟲的目的.比如雙對氯苯基三氯乙烷和除蟲菊酯等阻遏昆蟲軸突的傳導(dǎo)；六氯環(huán)己烷和六氯-環(huán)氧八氫-二甲撐萘等阻遏神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的傳導(dǎo).這幾種殺蟲劑都是通過阻礙害蟲的神經(jīng)傳導(dǎo)，使害蟲出現(xiàn)一系列中毒癥狀，包括興奮、抽搐痙攣、運(yùn)動失調(diào)和麻痹等，直至死亡[18-19].陳根強(qiáng)等[5]研究發(fā)現(xiàn),松油烯-4-醇作用于家蠅成蟲后也會表現(xiàn)出上述中毒癥狀.而本研究觀察到松油烯-4-醇作用于蚜蟲后也會出現(xiàn)一系列神經(jīng)中毒癥狀，其癥狀與松油烯-4-醇對家蠅和滴滴涕、擬除蟲菊酯類等神經(jīng)毒劑處理的昆蟲相似[6].

ATP酶可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)離子的濃度使其平衡，來保持細(xì)胞的靜息電位.Na+,K+-ATP酶具有維持細(xì)胞膜內(nèi)外Na+和K+濃度平衡的作用，其活性發(fā)生改變后，就會顯著影響細(xì)胞的穩(wěn)定，使細(xì)胞的代謝發(fā)生錯亂.研究表明，擬除蟲菊酯類殺蟲劑主要是通過影響昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中Na+,K+-ATP酶的活性從而導(dǎo)致昆蟲死亡[20-21].Na+,K+-ATP酶活性被抑制后，試蟲機(jī)體很快就會出現(xiàn)一系列反應(yīng)，隨后就會出現(xiàn)神經(jīng)中毒的癥狀[22].本研究發(fā)現(xiàn)，松油烯-4-醇對蠶豆蚜蟲熏蒸和觸殺處理后，都會顯著抑制Na+,K+-ATP酶的活性，且觸殺的抑制效果大于熏蒸的抑制效果.結(jié)合馬志卿等[23-24]的研究結(jié)果：松油烯-4-醇對粘蟲和家蠅的Na+,K+-ATP酶的活性也都具有良好的抑制作用，所以，松油烯-4-醇的主要作用靶標(biāo)極有可能是Na+,K+-ATP酶.目前其殺蟲機(jī)理還不清楚，推測可能與擬除蟲菊酯類殺蟲劑相似，還需進(jìn)一步研究.

遲家家等[25]測定了吡蟲啉、高效氯氰菊酯、阿維菌素、毒死蜱和吡蚜酮等幾種殺蟲劑對豆蚜的毒力大小(24 h)，其LC50值分別為0.247,0.262,0.381,0.386,35.710 mg/L.本實(shí)驗(yàn)測得松油烯-4-醇對蠶豆蚜蟲的LC50和LD50值分別為4.834 2 mg/L,10.282 7 μg/aphid.所以，松油烯-4-醇對蚜蟲具有很強(qiáng)的熏蒸和觸殺毒力.目前化學(xué)農(nóng)藥的泛濫使用及其帶來的環(huán)境問題，使人們意識到尋找和研發(fā)新型生物農(nóng)藥的重要性.新農(nóng)藥研發(fā)主要是通過從已知的天然產(chǎn)物中提取有殺蟲活性的成分，松油烯-4-醇廣泛存在于多種植物精油中，且該化合物對人、畜及環(huán)境都安全[26-27]，可以嘗試?yán)迷摶衔镩_發(fā)合成出更安全高效且對環(huán)境無污染的新型植物源農(nóng)藥.