邵 楠， 陳曼曼， 朱雨飛， 陳文榮， 宗 宇，李永強(qiáng)， 廖芳蕾， 郭衛(wèi)東， 楊 莉

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

表觀遺傳是指在植物體發(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程中，基因序列不發(fā)生改變，而基因表達(dá)發(fā)生可遺傳的改變，主要涉及DNA甲基化、組蛋白共價(jià)修飾、染色質(zhì)重塑、基因沉默與RNA編輯等調(diào)控機(jī)制[1-4].DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因組常見(jiàn)的共價(jià)修飾形式之一.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基轉(zhuǎn)移到特定DNA序列的堿基上，主要以5-甲基胞嘧啶(5mC)形式發(fā)生于對(duì)稱(chēng)序列CG,CHG(H=A,C或T)，以及非對(duì)稱(chēng)序列CHH[3-5].植物中至少有4種胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶，包括維持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferases，METs)家族、結(jié)構(gòu)域重組甲基化酶(domains rearranged methyltransferases，DRMs)、染色質(zhì)甲基化酶(chromomethylases，CMTs)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2(DNA methyltransferases,Dnmt 2)家族[3,6-7].越來(lái)越多的研究表明，DNA甲基化在植物生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中發(fā)揮重要作用，可影響植物株高、花型、果實(shí)著色、抗病性、生育期及其與環(huán)境的互作等[2-4,8].

藍(lán)莓為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)植物，多年生落葉或常綠灌木或小灌木[9].藍(lán)莓果實(shí)因富含花青素、多種人體必需氨基酸及硒等營(yíng)養(yǎng)成分，被譽(yù)為“21世紀(jì)功能性保健漿果”.與其他水果相比，藍(lán)莓果實(shí)單果重輕(約1.0 g)、產(chǎn)量低(畝產(chǎn)約1 000 kg)、不耐貯運(yùn)，因此,培育或篩選大果型、高產(chǎn)、抗病蟲(chóng)害、耐貯運(yùn)且便于機(jī)械操作的藍(lán)莓果實(shí)是果樹(shù)育種者的主要目標(biāo)[10-11].目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藍(lán)莓果實(shí)的研究主要集中在品質(zhì)、貯藏加工、花青苷合成及調(diào)控機(jī)制等方面[12-17]，鮮有DNA甲基化與藍(lán)莓果實(shí)發(fā)育的相關(guān)研究.本實(shí)驗(yàn)以果實(shí)較大的藍(lán)莓果實(shí)品種‘奧尼爾’(O′N(xiāo)eal)與小果品種‘藍(lán)雨’(Bluerain)為研究材料，分離DNA甲基化基因MET1 cDNA序列，研究其果實(shí)在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步探討這些基因在藍(lán)莓果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中的生物學(xué)功能與分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料為定植于浙江師范大學(xué)生物園6年生的藍(lán)莓(V.corymbosum)‘奧尼爾’與‘藍(lán)雨’果實(shí)，將鈴鐺花期(去除花瓣，僅保留花托與子房)標(biāo)記為S0期，取果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育曲線(xiàn)特定時(shí)期樣品，每個(gè)時(shí)期采樣20～50個(gè)果實(shí).以‘奧尼爾’為例，果實(shí)取樣時(shí)狀態(tài)參見(jiàn)圖1.S5期及以后的果實(shí)取回后，迅速用手術(shù)刀切成小塊.處理后的樣品經(jīng)液氮速凍后，凍存于-80 ℃?zhèn)溆?

圖1 ‘奧尼爾’藍(lán)莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中各時(shí)期取樣點(diǎn)

1.2 總RNA的提取及cDNA一鏈合成

參照張彥蘋(píng)等[18]建立的改良SDS法提取各時(shí)期混合樣品總RNA，DNase I去除殘留的基因組DNA.RNA經(jīng)凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)質(zhì)量與濃度后，取1 μg參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent kit with gDNA Eraser(TakaRa)說(shuō)明書(shū)合成cDNA一鏈，保存于-20 ℃?zhèn)溆?

1.3 VcMET1基因cDNA分離及序列分析

根據(jù)IGB(integrated genome browser 8.4.4)軟件發(fā)布的藍(lán)莓序列(VcMET1：cuff.5305.1)設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)，以‘奧尼爾’S1期cDNA為模板，應(yīng)用PCR法分別分離VcMET1基因編碼區(qū)cDNA，連接至T載體后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，每個(gè)基因重復(fù)3次擴(kuò)增與測(cè)序.所用引物由擎科生物技術(shù)(杭州)有限公司(Tsingke)合成.

利用NCBI 網(wǎng)站生物學(xué)軟件BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行cDNA及氨基酸序列同源性比對(duì)；在線(xiàn)軟件Translate(http://web.expasy.org/translate/)推導(dǎo)其氨基酸序列；在線(xiàn)軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)編碼蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)等；MEGA 6.0軟件(應(yīng)用neighbor-joining法，模式為p-distance,gap空位為Complete deletion，校驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為Bootstrap=1 000)構(gòu)建氨基酸序列進(jìn)化樹(shù).

表1 藍(lán)莓DNA甲基化相關(guān)基因VcMET1基因分離及表達(dá)引物

1.4 VcMET1基因在果實(shí)發(fā)育中的表達(dá)分析

根據(jù)分離得到的cDNAs序列，應(yīng)用Primer 3 Input (version 0.4.0，http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)在線(xiàn)軟件設(shè)計(jì)qPCR定量分析引物(見(jiàn)表1)，以VcGAPDH基因?yàn)閮?nèi)參[14]，使用StepOne PlusTMqPCR儀，按照SYBR?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，大連)配制反應(yīng)體系，采用二步法檢測(cè)VcMET1基因在藍(lán)莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平.每個(gè)樣品重復(fù)3～6次，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù).qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性3 s，60 ℃退火及延伸45 s，40次循環(huán)，每個(gè)循環(huán)第2步最后5 s采集熒光信號(hào).反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析及瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物特異性.采用2-ΔΔCT法[19]分析qPCR數(shù)據(jù)，應(yīng)用Origin 7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 VcMET1基因的分離與序列生物信息學(xué)分析

利用已經(jīng)公布的藍(lán)莓序列，應(yīng)用PCR擴(kuò)增的方法，從‘奧尼爾’S3期果實(shí)中成功分離出VcMET1基因(GenBank登錄號(hào)：KY964443.1)編碼區(qū)cDNA序列.測(cè)序序列表明該基因的開(kāi)放閱讀框包含4 647 bp，編碼1 548個(gè)氨基酸殘基，分子量為174.76 kDa，等電點(diǎn)5.70，不穩(wěn)定系數(shù)為43.08，GRAVY(總平均親水性)值為-0.516.

分析推導(dǎo)的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，VcMET1包含2個(gè)N端調(diào)控區(qū)的復(fù)制叉作用位點(diǎn)DNMT1-RFD結(jié)構(gòu)域，2個(gè)參與DNA甲基化、復(fù)制與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的BAH(Bromo adjacent homology domain)結(jié)構(gòu)域及1個(gè)胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶(Dcm)結(jié)構(gòu)域.進(jìn)一步將分離的VcMET1序列與其他植物相關(guān)蛋白進(jìn)行蛋白聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，VcMET1與香瓜類(lèi)似的MET1B蛋白(XP_008464733)有70%的相似性，并介于一年生草本與木本植物之間(見(jiàn)圖2)，表明VcMET1蛋白具有一定的保守性，但在進(jìn)化過(guò)程中也存在物種差異性.

2.2 VcMET1基因在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)分析

應(yīng)用qPCR技術(shù)，分析了VcMET1基因在藍(lán)莓果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中的相對(duì)表達(dá)水平.如圖3所示，‘奧尼爾’與‘藍(lán)雨’果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中VcMET1基因呈先上升再下降趨勢(shì)，并在果實(shí)發(fā)育早期(S0～S4期)的表達(dá)豐度顯著高于中后期的果實(shí).‘奧尼爾’在果實(shí)發(fā)育早期VcMET1基因表達(dá)豐度相對(duì)較低，在果實(shí)快速生長(zhǎng)階段(S3～S4期)表達(dá)快速上升，極顯著高于同時(shí)期‘藍(lán)雨’果實(shí)，并在果實(shí)后期及成熟期(S6～S7期)表達(dá)水平下降至發(fā)育初期的1/3～1/2.‘藍(lán)雨’果實(shí)發(fā)育初期(S0～S1期)VcMET1基因表達(dá)顯著高于‘奧尼爾’，分別是‘奧尼爾’的2.26倍與6.08倍，隨后表達(dá)豐度急劇下降，直至無(wú)法檢測(cè)(S4～S7期).

圖2 藍(lán)莓VcMET1與其他植物相應(yīng)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 藍(lán)莓果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中VcMET1基因相對(duì)表達(dá)分析

3 討論

DNA甲基化是重要的表觀遺傳現(xiàn)象，對(duì)于維持植物正常生長(zhǎng)發(fā)育必不可少，參與基因表達(dá)的調(diào)控，如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化等[1-4，8].植物中DNA甲基化程度主要受體內(nèi)甲基化酶與去甲基化酶的調(diào)控，DNA甲基化水平過(guò)高或過(guò)低，均會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育異常或表型異常.在已知的3類(lèi)典型DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中，MET1主要在重復(fù)及單拷貝DNA序列中維持CG基序中胞嘧啶的甲基化，與哺乳動(dòng)物Dnmt1功能類(lèi)似.目前，已知擬南芥中存在4條AtMET1(MET1，MET2a，MET2b與MET3)，甜橙[20]與番茄[8]中也分別分離到一條MET1序列.本實(shí)驗(yàn)僅從藍(lán)莓中分離出1條VcMET1基因序列，可能原因在于藍(lán)莓基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)不完善，還存在其他的VcMET1同源基因.

與其他植物相比，藍(lán)莓DNA甲基化酶基因VcMET1推導(dǎo)的氨基酸序列包含植物中相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域，序列相似度也較高，表明DNA甲基化酶基因VcMET1在植物進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守.除催化甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的MTase結(jié)構(gòu)域外，VcMET1中還存在其他蛋白識(shí)別、結(jié)合與調(diào)控的結(jié)構(gòu)域BAH和DNMT1-RFD等，與前人報(bào)道中DNA甲基化酶并非單獨(dú)作用，而與其他蛋白質(zhì)以蛋白復(fù)合體的形式催化特定位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化的結(jié)論吻合[3-4，21].

在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，特別是果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程中DNA甲基化水平呈動(dòng)態(tài)變化[3-4]，推測(cè)DNA甲基化酶在相應(yīng)時(shí)期快速合成或降解，以維持其在相應(yīng)階段的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì).Hadfield等[22]發(fā)現(xiàn)番茄果實(shí)在成熟過(guò)程中DNA甲基化程度下降，與DNA甲基化基因的表達(dá)降低相偶聯(lián).進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著果實(shí)的成熟，DNA甲基化水平在果皮中降低，在腔室中變化不顯著；SlMET1在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中呈下降趨勢(shì)，在幼果中表達(dá)豐度極高.CsMET1在甜橙‘暗柳’與‘紅暗柳’果肉中隨果實(shí)成熟表達(dá)上調(diào)，與果實(shí)后期甲基化水平上升相符[20].本研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓VcMET1在果實(shí)發(fā)育早中期表達(dá)豐度較高，后期表達(dá)迅速下降，甚至無(wú)法檢測(cè).除了基因表達(dá)模式不同，不同植物中DNA甲基化的程度與分布也存在較大差異[3，23-24]，表明DNA甲基化在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的非模式植物中可能具有更為重要的作用，并且DNA的甲基化與去甲基化系統(tǒng)協(xié)同作用，共同決定基因組中DNA甲基化水平.

現(xiàn)已證明，DNA甲基化在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著極其重要的作用，但大多數(shù)研究停留于擬南芥、水稻與番茄等模式植物.其他植物,尤其是對(duì)果樹(shù)果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中的相關(guān)研究報(bào)道較少，開(kāi)展這方面的研究為深入解析DNA甲基化對(duì)果實(shí)發(fā)育的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ).本研究從藍(lán)莓中分離出DNA甲基化相關(guān)基因VcMET1，以及在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中的表達(dá)模式，而有關(guān)其他DNA甲基化與去甲基化相關(guān)基因的信息，以及藍(lán)莓果實(shí)中DNA甲基化的程度與分布，如何作用于果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育，仍有待于深入研究.