王鳳 金笑平 王恩 王皖芬 鄭周 胡曉飛 何欣威 胡彩虹 應(yīng)忠明

急性腦梗死占腦卒中的60%～80%[1]，其重要發(fā)病機(jī)制是在大動脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上，頸動脈粥樣易損斑塊突然破損、血小板激活和血栓形成。目前關(guān)于頸動脈易損斑塊形成機(jī)制的研究已深入到分子和基因水平[2-3]。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A（MEF2A）在血管平滑肌中高度表達(dá)，并對細(xì)胞的存活或凋亡起著關(guān)鍵作用[4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MEF2A基因多態(tài)性與缺血性心臟病、心力衰竭、精神分裂癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[5-7]。MEF2A基因多態(tài)性可引起轉(zhuǎn)錄異常，進(jìn)而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，血管內(nèi)皮發(fā)育不正常或缺陷會導(dǎo)致炎癥和粥樣斑塊形成，繼發(fā)血栓、心肌梗死和猝死[7]。MEF2A的第11外顯子存在多個(gè)多種基因多態(tài)性位點(diǎn)，包括短串聯(lián)重復(fù)序列 rs376557691 的（CAG）n（1257-1290）、DNA片段長度多態(tài)性rs759657998的CCG缺失（1291-1293）、單核甘酸多態(tài)性 rs367780642（1299A/G）等。Han 等[8]發(fā)現(xiàn)MEF2A基因第11外顯子的CAG重復(fù)序列多態(tài)性與中國人冠心病有關(guān)，當(dāng)CAG重復(fù)序列數(shù)為9時(shí)，是冠心病的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測因子。Xu等[9]研究發(fā)現(xiàn)MEF2A基因第11外顯子1671-1677的“CAGCCG缺失”與一個(gè)包含34例家系的早發(fā)性冠心病/心肌梗死相關(guān)。目前關(guān)于MEF2A基因多態(tài)性的研究集中在其與冠狀動脈粥樣硬化及心肌梗死的關(guān)系上，但與發(fā)病機(jī)制如頸動脈易損斑塊的關(guān)系尚未見報(bào)道?；贛EF2A基因存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，筆者探討了MEF2A基因第11外顯子多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與頸動脈易損斑塊的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 連續(xù)收集2007年1月至2016年12月浙江省臺州醫(yī)院收治的無血緣關(guān)系且首次診斷為腦梗死的患者660例，所有患者符合缺血性腦卒中診治指南中關(guān)于急性腦缺血性卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，且頭顱MRI或CT血管成像提示顱內(nèi)未見動脈粥樣硬化斑塊。根據(jù)頸動脈超聲檢查結(jié)果，將頸動脈有低回聲斑塊和混合性回聲斑塊的患者納入易損斑塊組（205例），頸動脈有高回聲斑塊的患者納入穩(wěn)定斑塊組（455例）[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤或自身免疫性疾??；合并血液病或嚴(yán)重肝腎疾病；合并心房纖顫、心力衰竭、瓣膜病、心肌病、心內(nèi)膜炎、附壁血栓或急性冠脈綜合征；合并妊娠或甲狀腺疾??；合并嚴(yán)重外傷史或感染性疾??；溶栓患者；最近3個(gè)月服用過降脂藥及抗血小板藥物。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 人血液基因組DNA提取試劑盒、DNA聚合酶、PCR Master Mix反應(yīng)液等購自中國上海捷瑞生物工程公司；特異性引物由中國上海捷瑞生物工程公司合成；DNA基因測序由中國上海生工生物工程公司完成。

1.2.2 標(biāo)本采集 抽取清晨空腹肘靜脈血2ml于加有抗凝劑的試管，分裝至1.5ml EP管。使用人血液基因組DNA抽提試劑盒，按照說明書進(jìn)行DNA抽提。提取好的DNA標(biāo)本儲存于-80°C冰箱。

1.2.3 頸動脈超聲檢查 由超聲科高年資醫(yī)師專人操作。舒張末期測量頸總動脈分叉處近端1cm、頸總動脈分叉處以及頸內(nèi)動脈起始段1cm后壁的內(nèi)中膜厚度，雙側(cè)各測量3次，取其平均值。

1.2.4 PCR檢測 （1）利用PCR從基因組DNA中特異性擴(kuò)增MEF2A基因第11外顯子。外顯子引物由上?；瞪镉邢薰竞铣?。U：TCAGTGCTGGAGGGCAGTTA，L：CAATTGGAGAATGGAAGTCGC。（2）反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5μl，Mg2+1.0μ（l25mol/L），Mix dNTP 0.5μl（10mmol/L），上、下游引物各0.5μ（l20μmol/L），TaqDNA聚合酶 0.25μl（5U/μl），DNA 模版 1.0μl，雙蒸水加至25μl。（3）反應(yīng)條件：94°C 預(yù)變性 5min；94°C 變性 45s，54°C 退火 45s，72°C 延伸 1min，循環(huán) 35 次；最后 72°延伸10min。（4）凝膠電泳：取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，用凝膠成像分析儀分析PCR產(chǎn)物特性。（5）序列分析：對瓊脂糖凝膠中目的DNA片段進(jìn)行切膠回收純化，純化DNA寄往上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA序列測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算兩組患者的基因型及等位基因頻率，等位基因頻率=（2×純合子數(shù)+雜合子數(shù)）（/2×受檢人群）。計(jì)量資料用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hardy-Weinberg平衡分析：rs367780642及rs759657998位點(diǎn)基因型及等位基因分布采用χ2檢驗(yàn)，rs376557691的（CAG）n基因分布采用SHEsis軟件分析，P＞0.05為符合Hardy-Weinberg平衡。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般特征比較 頸動脈易損斑塊組與穩(wěn)定斑塊組患者的性別、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、LDL、糖尿病史比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而年齡、Fb、TG、TC、HDL、高血壓病史、吸煙史、飲酒史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者一般特征比較

2.2 MEF2A基因測序結(jié)果 rs367780642位點(diǎn)檢測到GG基因型和GA基因型，兩組患者基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）；rs759657998位點(diǎn)檢測到CCG/CCG基因型和-/CCG基因型，兩組患者基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。易損斑塊組與穩(wěn)定斑塊組rs367780642位點(diǎn)的GG、GA基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；等位基因G、A頻率比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；易損斑塊組與穩(wěn)定斑塊組rs759657998位點(diǎn)的CCG/CCG、-/CCG基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；等位基因CCG、CCG缺失頻率比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。部分樣本MEF2A基因第11外顯子的測序結(jié)果，見圖1。

圖1 部分樣本MEF2A基因第11外顯子的測序結(jié)果[a：（CAG）9純合子，可見9個(gè)CAG重復(fù)序列；b：（CAG）10純合子；c：（CAG）11純合子；d：（CAG）9與（CAG）10的雜合子；e：rs759657998其中1條DNA鏈的1個(gè)CCG缺失，致后面堿基CCA序列前移，從而出現(xiàn)CCG+CCA重疊（箭頭所示）；f：rs367780642位點(diǎn)存在GG基因型和GA基因型（箭頭所示）]

表2 兩組患者M(jìn)EF2A基因各位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較[例（%）]

2.3 CAG重復(fù)單元的單個(gè)等位基因分布 rs376557691的CAG重復(fù)單元的數(shù)目不等，部分樣本測序結(jié)果見圖1。（CAG）n主要集中在9～11個(gè)，采用SHEsis軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡分析，兩組患者CAG基因均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。除（CAG）9～11外，其他CAG重復(fù)單元的等位基因比例均＜5%，見表3。因此，參考Han等[8]統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，將所發(fā)現(xiàn)的等位基因分成 4 類，即（CAG）9、（CAG）10、（CAG）11 和其他 CAG 重復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組患者CAG重復(fù)單元的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 4。

表3 CAG重復(fù)單元的單個(gè)等位基因比例[例（%）]

表4 兩組患者M(jìn)EF2A基因rs376557691位點(diǎn)的CAG等位基因頻率比較[例（%）]

3 討論

MEF2屬轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，其家族成員在脊柱動物中包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D。MEF2A在血管平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育、功能和結(jié)構(gòu)維持中起著重要的調(diào)控作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，MEF2A可通過激活p38MAPK信號依賴途徑刺激血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的單核細(xì)胞趨化蛋白1表達(dá)，從而介導(dǎo)血管炎癥反應(yīng)[11]。MEF2A還可通過與miR-143相互作用調(diào)節(jié)過氧化氫誘導(dǎo)的血管平滑肌的凋亡[12]。此外，MEF2A基因顯性負(fù)突變和RNA沉默，可以通過p38MAPK信號通路誘導(dǎo)血管平滑肌表型轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移明顯增加[13]。而平滑肌細(xì)胞的增殖與凋亡通過參與纖維帽變薄、細(xì)胞外基質(zhì)減少、細(xì)胞碎片聚集和內(nèi)膜炎癥反應(yīng)，從而影響粥樣硬化易損斑塊的形成。

MEF2A基因的遺傳變異導(dǎo)致MEF2A蛋白構(gòu)象的改變，不僅會影響MEF2A在細(xì)胞核內(nèi)的定位，也會減弱由MEF2A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活[7]。MEF2A第11外顯子具有多個(gè)多種基因多態(tài)性位點(diǎn)，由于研究對象、研究方法及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法等差異，研究結(jié)果各有不同。戴大鵬等[14]通過PCR及PCR產(chǎn)物直接測序技術(shù)法研究MEF2A基因的CAG三聯(lián)核苷酸重復(fù)序列與北京人群冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)（CAG）n與冠心病的發(fā)生有關(guān)。Hsu等[15]通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析中國臺灣258例冠心病患者及258例對照者的MEF2A基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEF2A第11外顯子（CAG）n等位基因在冠心病組與對照組中的分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Lieb等[16]主要通過PCR及單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測白種人MEF2A基因第11外顯子（CAG）n及內(nèi)含子1、8、9等多個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者與對照組多態(tài)性位點(diǎn)分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Han等[8]主要通過PCR及單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測分析漢族冠心病患者，發(fā)現(xiàn)冠心病組（CAG）9的等位基因頻率高于對照組，推測CAG重復(fù)的多態(tài)性可能影響了轉(zhuǎn)錄水平的傳統(tǒng)剪接，繼而在翻譯過程中形成了不同的異構(gòu)體和截短蛋白，導(dǎo)致在核定位、DNA結(jié)合、配體結(jié)合、二聚化等過程中的競爭性抑制。Dai等[17]在1例早發(fā)冠心病的家系中發(fā)現(xiàn)，3/5的成員檢測出rs759657998（-/CCG）位點(diǎn)存在CCG缺失突變，認(rèn)為單倍型1291-1293 CCG缺失+1305G+1353T與早發(fā)冠心病明顯相關(guān)。Liu等[18]在一項(xiàng)病例對照研究中通過基因測序方法分析rs367780642和rs759657998位點(diǎn)在冠心病患者與對照組中的差異，結(jié)果提示兩組患者2個(gè)位點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究選擇了MEF2A基因中目前研究最多且存在多種基因多態(tài)性的第11外顯子其中一段300bp左右的DNA片段進(jìn)行測序分析，該段外顯子包含了基因多態(tài)性最常見的DNA重復(fù)序列多態(tài)性rs376557691的（CAG）n（1257-1290）、單核苷酸多態(tài)性rs367780642（1299A/G）、DNA片段長度多態(tài)性rs759657998的CCG缺失（1291-1293）。與國內(nèi)外研究結(jié)果基本一致的是：本研究rs376557691位點(diǎn)的（CAG）n主要集中在9～11個(gè)，為編碼谷氨酰胺的重復(fù)。因其他（CAG）n的單個(gè)等位基因比例均＜5%，筆者參照了Han等[8]統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，將（CAG）9、（CAG）10、（CAG）11 和其他 CAG 重復(fù)進(jìn)行比較，兩組間等位基因分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本組研究對象被發(fā)現(xiàn)在rs759657998（-/CCG）位點(diǎn)中存在CCG缺失，rs367780642位點(diǎn)存在A/G多態(tài)性；此外，易損斑塊組與穩(wěn)定斑塊組rs759657998（-/CCG）和rs367780642位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者與漢族人易損斑塊形成無關(guān)，且排除其他混雜因素影響后差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，MEF2A基因第11外顯子（CAG）n的等位基因分布可能與漢族人群急性大動脈粥樣硬化性頸動脈易損斑塊的易患性無關(guān)，且rs367780642位點(diǎn)A/G多態(tài)性及rs759657998的CCG缺失與漢族人群急性大動脈粥樣硬化性頸動脈易損斑塊亦無關(guān)。但本研究對象較為局限，且僅對該外顯子中一段300bp左右的DNA片段進(jìn)行測序分析，在種族和MEF2A基因第11外顯子其他復(fù)雜的基因多態(tài)性及功能上有待進(jìn)一步研究。