林輝 徐丹萍 諸溢揚(yáng) 鄭路亞
在我國,胃癌發(fā)病率居所有惡性腫瘤的前三位,且有明顯的地域差異。胃癌發(fā)病年齡集中在50歲以上人群,且男女發(fā)病率明顯失衡。人白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體 1(leukocyte-associated Ig-like receptor 1,LAIR1)幾乎表達(dá)于所有免疫細(xì)胞,包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞及肥大細(xì)胞等[1]。LAIR1的細(xì)胞質(zhì)尾有2個(gè)ITIM基序,體外研究表明LAIR1通過單克隆抗體與分子間的交聯(lián)反應(yīng),使細(xì)胞質(zhì)尾的ITIM基序的酪氨酸磷酸化,再招募SHP-1、SHP-2和Csk發(fā)揮免疫抑制功能[2]。查詢國外千人項(xiàng)目基因組測序數(shù)據(jù)庫(IGSR)發(fā)現(xiàn),中國西雙版納傣族與北京漢族人種LAIR1基因3’非翻譯區(qū)(3’UTR)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)基因型分布頻率存在明顯差異。而本研究對(duì)胃癌與慢性胃炎患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點(diǎn)基因分布頻率進(jìn)行分析,以探討其與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。
1.1 對(duì)象 選取2014年10月至2015年9月在本院經(jīng)胃鏡下組織活檢確診的121例胃癌患者為胃癌組,其中男 91 例,女 30 例;年齡 30~87[64(57,71)]歲;腫瘤類型:鱗癌1例,腺癌95例,印戒細(xì)胞癌4例,腺癌+印戒細(xì)胞癌20例,神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例。121例患者中92例接受胃癌根治術(shù),明確腫瘤分化程度:中高分化41例,低分化51例;TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期34例,Ⅲ~Ⅳ期58例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率為36.5%。選取同期本院收治且年齡、性別與胃癌患者匹配的126例慢性胃炎患者為對(duì)照組,均接受過胃鏡檢查,胃鏡下可見橢圓形、圓形潰瘍或糜爛,組織活檢結(jié)果為慢性胃炎;其中男94例,女32例;年齡 35~75[60(51,65)]歲。在 IGSR 查詢到傣族、北京漢族和南方漢族人種LAIR1基因3’UTR的SNP位點(diǎn)詳細(xì)信息,見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。
表1 LAIR1基因3’UTR的6個(gè)SNP位點(diǎn)詳細(xì)信息
1.2 一代測序法檢測LAIR1基因3’UTR序列 取乙二胺四乙酸抗凝血,按照血液DNA抽提試劑盒操作說明書(GK1072,100T,上海捷瑞生物工程有限公司)對(duì)外周血全基因組DNA進(jìn)行抽提。在保守區(qū)域設(shè)置引物,采用正向引物L(fēng)AIR1F-5′-CCCACAGTCCACAAAGCCCAT-3′,反向引物 LAIR1R-5′-TGAGATTCTGCCGCCTCCTAGT-3′對(duì) LAIR1 基因的 3’UTR 的 (19∶5355287-54355435)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物片段長度為1 212bp,經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行確認(rèn)。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收純化,同時(shí)在中間段設(shè)置測序引物 LAIR1M-5′-TGCGTGGAGTAAAGCACAACCC-3′,采用一代測序儀(Applied Biosystems)進(jìn)行正向及中段測序。
1.3 序列比對(duì) 通過dbSNP數(shù)據(jù)庫在19號(hào)染色體5355287-54355435位(LAIR1基因3’UTR)可查詢到267個(gè)SNP位點(diǎn),兩組患者的測序結(jié)果采用序列比對(duì)工具BLAST進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)主要存在6個(gè)SNP位點(diǎn),見表1和圖1。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。胃癌組與對(duì)照組患者基因型及等位基因分布頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法,并計(jì)算OR值及其95%CI來評(píng)估胃癌患者的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖1 LAIR1基因3’UTR的6個(gè)SNP位點(diǎn)的測序圖
2.1 LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性檢測結(jié)果 兩組患者LAIR1基因3’UTR的 6個(gè)SNP位點(diǎn)基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)。胃癌組患者rs199714928位點(diǎn)G/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于對(duì)照組,G/G基因型及等位基因G分布頻率均明顯高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表 2~3。胃癌組 rs1054033 與 rs6509867 位點(diǎn)均存在完全單倍型連鎖現(xiàn)象,而對(duì)照組有16例存在不完全單倍型連鎖現(xiàn)象(P<0.05),見表4。
2.2 LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性與胃癌分化程度的關(guān)系 不同胃癌分化程度患者LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性位點(diǎn)基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(均P>0.05)。胃癌低分化患者rs3826753/rs3826754位點(diǎn)A/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于中高分化者,等位基因G分布頻率明顯高于中高分化者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表5~6。不同性別、腫瘤類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點(diǎn)基因分布頻率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。
表2 兩組患者LAIR1基因3’UTR區(qū)6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布頻率比較[例(%)]
表3 兩組患者LAIR1基因3’UTR區(qū)6個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因分布頻率比較[例(%)]
表4 兩組患者LAIR1基因3'UTR區(qū)rs1054033與rs6509867等位基因連鎖比較[例(%)]
LAIR1早在1997年就被克隆,同時(shí)發(fā)現(xiàn)它被DX26抗體識(shí)別與結(jié)合后可抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒功能[3-5]。LAIR1是由287個(gè)氨基酸序列組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白,包含了獨(dú)特的膜外C2型Ig樣區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)尾的2個(gè)ITIM基序[1,6]。根據(jù)分化抗原簇,LAIR1又被命名為CD305,在結(jié)構(gòu)上與其他定位在染色體19q13.4上的淋巴細(xì)胞受體復(fù)合物的抑制性Ig超家族成員相似。研究發(fā)現(xiàn),LAIR1基因參與抑制粒細(xì)胞-單核細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)誘導(dǎo)急性髓系白血病細(xì)胞增殖,與膠原蛋白結(jié)合后強(qiáng)烈抑制GM-CSF介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加、磷酸化、AKT1/PKBα活化[7]。LAIR1基因的功能性配體是膠原蛋白,當(dāng)羥脯氨酸存在時(shí)具有高親和性。體外研究發(fā)現(xiàn),不管是細(xì)胞系還是原發(fā)細(xì)胞中的膠原蛋白,與LAIR1基因結(jié)合均能直接抑制免疫細(xì)胞的生物學(xué)活性[8]。LAIR1基因廣泛表達(dá)且其周圍存在大量配體,因此必須調(diào)節(jié)LAIR1基因/膠原蛋白的相互反應(yīng),從而確保免疫系統(tǒng)的平衡。一方面,作用于細(xì)胞的活化信號(hào)強(qiáng)度由LAIR1基因/膠原蛋白的交聯(lián)反應(yīng)來決定信號(hào)是否被抑制;另一方面,LAIR1基因表達(dá)水平?jīng)Q定其與膠原蛋白反應(yīng)的抑制水平。
表5 LAIR-1基因3’UTR區(qū)6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布頻率與胃癌分化程度的關(guān)系
表6 LAIR-1基因3’UTR區(qū)6個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因分布頻率與胃癌分化程度的關(guān)系
目前關(guān)于LAIR1基因與實(shí)體瘤的關(guān)系研究較少。已有研究表明腫瘤患者血清可溶性LAIR1基因表達(dá)高于正常人,且外周血中NK細(xì)胞、CD4+及CD8+T細(xì)胞表面LAIR1基因表達(dá)明顯增加[9]。研究表明,宮頸癌組織及上皮卵巢癌組織LAIR1蛋白表達(dá)均高于正常癌旁組織,且與腫瘤大小、病理分期、臨床分級(jí)和淋巴結(jié)陽性數(shù)有關(guān)[10-11]。將LAIR1基因轉(zhuǎn)染到不表達(dá)LAIR1基因的Me-180細(xì)胞并使其穩(wěn)定表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)LAIR1蛋白會(huì)抑制細(xì)胞的增殖能力和抗凋亡能力[10]。然而,對(duì)表達(dá)LAIR1基因的HO-8910細(xì)胞進(jìn)行基因敲除并使其基因表達(dá)沉默,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞侵襲能力反而增強(qiáng)[11]。
本研究對(duì)胃癌與慢性胃炎患者LAIR1基因3’UTR的多態(tài)性進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌患者rs199714928位點(diǎn)G/G基因型及等位基因G分布頻率均明顯高于慢性胃炎患者;但在中國西雙版納傣族人種(93例)中發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)全為純化子(G/G),與此位點(diǎn)祖先等位基因G一致,這表明rs199714928位點(diǎn)部分G突變成A可能是生物進(jìn)化的原因,以保護(hù)機(jī)體抵抗胃癌的發(fā)生。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)胃癌患者rs1054033與rs6509867位點(diǎn)均存在完全的C-G和T-T單倍型連鎖現(xiàn)象,而慢性胃炎患者存在16例突破該連鎖現(xiàn)象的T-G單倍型。可見,rs1054033與rs6509867位點(diǎn)出現(xiàn)T-G單倍型是一種保護(hù)機(jī)體抵抗胃癌發(fā)生的現(xiàn)象。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),胃癌低分化患者rs3826753/rs3826754位點(diǎn)A/A基因型及等位基因A分布頻率均明顯低于中高分化者,等位基因G分布頻率明顯高于中高分化者;而不同性別、腫瘤類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率患者LAIR1基因3’UTR的SNP位點(diǎn)基因分布頻率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
綜上所述,LAIR1基因3’UTR的rs199714928位點(diǎn)多態(tài)性可能是胃癌發(fā)生的易感因素;rs1054033與rs6509867位點(diǎn)存在不完全單倍型連鎖(T-G單倍型)可能是一種保護(hù)機(jī)體抵抗胃癌發(fā)生的有利因素。