李慶國(guó) 劉翠蘭 姚俊修 王因花 王開(kāi)芳 任飛 燕麗萍 吳德軍

摘要：白蠟是我國(guó)一種常見(jiàn)綠化樹(shù)種，因緯度位置、海拔高度和海陸分布等自然地理因素不同，造成地區(qū)之間種質(zhì)資源的自然差異。真實(shí)性和純度是種質(zhì)資源檢測(cè)的重要指標(biāo)之一，因此建立快速、精準(zhǔn)、便捷的 SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)于白蠟種質(zhì)的溯源及新品種授權(quán)具有重要意義。本研究以2013年山東省林業(yè)科學(xué)研究院在白蠟種質(zhì)資源調(diào)查項(xiàng)目中采集并保存的38份白蠟為試材，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)我國(guó)不同緯度地區(qū)的白蠟種質(zhì)資源進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，從150對(duì)候選引物中成功篩選出15條特異性強(qiáng)、條帶清晰的引物作為核心引物，共檢測(cè)出3.8個(gè)基因型，每對(duì)引物擴(kuò)增的基因型2～6個(gè)不等。并構(gòu)建白蠟DNA指紋圖譜，采用5對(duì)引物組合即可將38份白蠟種質(zhì)完全區(qū)分。聚類分析結(jié)果表明，白蠟種質(zhì)間的親緣關(guān)系與緯度因素具有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：白蠟；中低緯度地區(qū)；SSR；DNA 指紋圖譜；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S792.41：Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2018）08-0019-05

Construction of DNA Fingerprinting and Analysis of

Genetic Diversity with SSR Markers for Fraxinus sp.

in Mid-Latitudes and Low-Latitudes of China

Li Qingguo1， Liu Cuilan1，2，Yao Junxiu1，2， Wang Yinhua1，2，

Wang Kaifang1，2，Ren Fei1，Yan Liping1，2，Wu Dejun1，2

（1. Shandong Academy of Forestry Sciences， Jinan 250014， China；

2. Shandong Provincial Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement， Jinan 250014， China）

Abstract Fraxinus is a kind of common greening tree species in China. Because of the latitude， altitude，sea land distribution and other different natural geographic factors， the natural differences are present between regions and germplasm resources. The authenticity and purity are one of the important indexes for germplasm resource detection. Therefore， it is of great significance to establish a rapid， accurate and convenient DNA molecular marker technique for the traceability of Fraxinus germplasms and the authorization of new varieties. In this study， 38 samples of Fraxinus collected and preserved by Shandong Academy of Forestry Sciences in 2013 were tested. The construction of DNA fingerprinting and analysis of genetic diversity with SSR markers were conducted for Fraxinus in mid-latitudes and low-latitudes. And 15 primers with high specificity and clear bands were selected as core primers from 150 pairs of candidate primers. A total of 3.8 genotypes were detected， and each pair of primers amplified 2～6 genotypes. The Fraxinus could be distinguished by 5 primers. This indicated that there were correlations between phylogenetic relationships and geographic origin of different varieties.

Keywords Fraxinus； Mid-latitudes and low-latitudes； SSR； DNA fingerprinting； Genetic diversity

白蠟由于其耐鹽性極強(qiáng)、觀賞價(jià)值高和分布范圍廣等特點(diǎn)，被國(guó)內(nèi)許多省市廣泛引種栽培，是目前應(yīng)用最廣泛的綠化樹(shù)種之一[1]。國(guó)內(nèi)對(duì)白蠟育種的研究起步比較早，但多限于對(duì)絨毛白蠟的變異觀測(cè)和人工林栽培選擇育種方面，且未廣泛采用生物技術(shù)等新興技術(shù)開(kāi)展研究，致使白蠟遺傳育種方面的研究遲滯不前，培育出的優(yōu)良品種很少[2，3]，在一定程度上造成白蠟種質(zhì)資源的浪費(fèi)；同時(shí)，現(xiàn)有白蠟種間鑒別不清的問(wèn)題也普遍存在[4]，白蠟種內(nèi)的變異類型沒(méi)有一致的劃分標(biāo)準(zhǔn)，分類不明晰，缺少白蠟種質(zhì)基因庫(kù)以及種質(zhì)資源保護(hù)、評(píng)價(jià)、推廣和利用的綜合體系建設(shè)[5]。由于形態(tài)鑒定的時(shí)效性差，極易受到環(huán)境與主觀因素的影響，使得依據(jù)形態(tài)性狀進(jìn)行品種田間檢驗(yàn)的難度越來(lái)越大[6]，品種多、雜、亂的現(xiàn)象難以得到有效控制。

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，采用分子標(biāo)記鑒別植物品種得到廣泛應(yīng)用。SSR分子標(biāo)記具有快速簡(jiǎn)單、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，基于此的DNA 指紋圖譜鑒定技術(shù)精準(zhǔn)、可靠，不受季節(jié)和環(huán)境的影響，是品種鑒定的最主要分子標(biāo)記技術(shù)之一[7]。國(guó)際植物新品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）在分子標(biāo)記測(cè)試指南中即采用SSR和SNP標(biāo)記方法構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，其中SSR標(biāo)記價(jià)廉、技術(shù)成熟，是目前植物基因組建庫(kù)的首選標(biāo)記[8]。近年來(lái)，科研人員已基于SSR標(biāo)記構(gòu)建了玉米[9]、甜瓜[10]、中國(guó)櫻桃[11]、杏[12]、杜仲[13]等的基因組DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。在白蠟樹(shù)種分子標(biāo)記研究方面，王健兵等[14]利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化了白蠟SSR反應(yīng)體系，篩選出多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)率均較高的SSR引物標(biāo)記，為白蠟種質(zhì)SSR分子標(biāo)記的鑒定奠定了基礎(chǔ)；胡春龍[15]采用SSR標(biāo)記方法，對(duì)白蠟種質(zhì)資源分子身份證及遺傳多樣性進(jìn)行了研究。但關(guān)于中國(guó)不同緯度地區(qū)的白蠟種質(zhì)開(kāi)展DNA指紋圖譜構(gòu)建及應(yīng)用的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用SSR標(biāo)記對(duì)2013年收集的中國(guó)不同緯度地區(qū)部分白蠟種質(zhì)進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建，并進(jìn)行遺傳多樣性分析，對(duì)白蠟品種鑒別、種質(zhì)資源管理、雜交育種、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和苗木質(zhì)量提高均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)所用的38份白蠟試材為2013年山東省林業(yè)科學(xué)研究院白蠟種質(zhì)資源調(diào)查項(xiàng)目組采自黑龍江、新疆、北京、甘肅、山東、陜西和湖南6個(gè)省市，均為當(dāng)?shù)貥?shù)齡長(zhǎng)且具有干形直、綠期長(zhǎng)等優(yōu)良特性的白蠟種質(zhì)（表1）。

1.2 DNA的提取及檢測(cè)

按照均勻分布、隨機(jī)采集的原則取白蠟試材的新鮮葉片并置于-50℃保存，采用改進(jìn) CTAB法提取基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，帶型清晰（圖1），符合實(shí)驗(yàn)要求。

1—13分別指白蠟1號(hào)—白蠟13號(hào)。

圖1 白蠟基因組DNA檢測(cè)

1.3 引物篩選和PCR擴(kuò)增

選取田間表型性狀差異較大的4份白蠟種質(zhì)提取DNA進(jìn)行SSR引物篩選，所用引物由山東省林業(yè)科學(xué)研究院通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)，初步選出150對(duì)SSR引物作為本研究的候選引物，由山東沃恩科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，5～10 ng/μL DNA模板0.2 μL，10 ng/μL PCR-Mix 5.5 μL，ddH2O 3.7 μL，共計(jì)10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，54～58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃ 10 min終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)：擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣3.5 μL，分子量標(biāo)準(zhǔn)為50 bp DNA Ladder，在200 V 電壓下預(yù)電泳30 min，之后電泳2 h，在0.1%的AgNO3 溶液中銀染，漂洗，NaOH 溶液中顯色[16]，凝膠掃描保存，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)后進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)SSR擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物在電泳凝膠上的大小和重復(fù)單元，每對(duì)引物產(chǎn)生的不同帶型，建立其DNA分子指紋圖譜。利用NTSYS-pc V 2.10軟件，將數(shù)據(jù)格式轉(zhuǎn)換為軟件計(jì)算格式，采用Popgene 32軟件計(jì)算I值（Shannons information index）和H值（Neis gene diverity），多態(tài)信息含量PIC值 （polymorphism information content）參考Nei的方法進(jìn)行計(jì)算[17]。采用最短距離法得出PUGMA親緣關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

用150對(duì)引物（Y1～Y150）對(duì)4份白蠟種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，初步篩選出15對(duì)特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的多態(tài)性引物，15對(duì)引物對(duì)38份白蠟材料的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2，共擴(kuò)增出57個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)2～6個(gè)不等，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出3.8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。不同位點(diǎn)的PIC值變化范圍為0.625 1～0.917 1，平均PIC值為0.807 7；I值最大為0.921 4，平均值為0.757 3；H值平均為0.777 9。一般認(rèn)為PIC>0.50時(shí)為高度多態(tài)性信息引物，當(dāng)0.25

2.2 品種指紋圖譜分析

利用篩選的15對(duì)引物對(duì)38份白蠟種質(zhì)進(jìn)行指紋分析，僅用1個(gè)特征引物Y132就可將白蠟7號(hào)、白蠟10號(hào)、白蠟13號(hào)、白蠟14號(hào)、白蠟15號(hào)、白蠟18號(hào)、白蠟23號(hào)、白蠟26號(hào)、白蠟32號(hào)、白蠟34號(hào)共計(jì)10份種質(zhì)與其它種質(zhì)區(qū)分開(kāi)。白蠟1號(hào)、白蠟3號(hào)和白蠟4號(hào)具有5個(gè)特征引物，白蠟2號(hào)、白蠟5號(hào)、白蠟9號(hào)、白蠟11號(hào)、白蠟20號(hào)和白蠟21號(hào)具有2個(gè)特征引物，白蠟25號(hào)具有3個(gè)特征引物。引物Y78、Y132在36份白蠟種質(zhì)上均表現(xiàn)出特征譜帶，說(shuō)明這兩個(gè)引物多態(tài)性豐富，特征譜帶穩(wěn)定，在進(jìn)行白蠟種質(zhì)指紋鑒定時(shí)可優(yōu)先采用。

從15 對(duì)引物中挑選多態(tài)性相對(duì)豐富的Y78、Y132和Y149引物進(jìn)行組合鑒別，可以鑒別26份種質(zhì)。Y55、Y78、Y132和Y149引物組合可鑒別34份種質(zhì)，白蠟1號(hào)、白蠟5號(hào)、白蠟6號(hào)、白蠟12號(hào)4個(gè)種質(zhì)無(wú)法區(qū)分，而引物Y39在這4份白蠟種質(zhì)中顯現(xiàn)出4種不同基因型，因此，采用Y39、Y55、Y78、Y132和Y149組合可將來(lái)自不同緯度地區(qū)的38份白蠟種質(zhì)完全區(qū)分開(kāi)。

2.3 不同來(lái)源地?zé)o性系之間的親緣關(guān)系

利用SSR標(biāo)記對(duì)38份白蠟種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢钥闯?，在0.63的聚類水平上，可以將38份種質(zhì)分為兩個(gè)大類。第一大類只有一份種質(zhì)白蠟18號(hào)，是課題組從湖南省引進(jìn)的種質(zhì)資源。第二大類包括37份種質(zhì)，在0.43的聚類水平上，可劃分為兩個(gè)亞類，第一亞類包括白蠟2號(hào)、白蠟4號(hào)、白蠟8號(hào)、白蠟10號(hào)、白蠟12號(hào)、白蠟14號(hào)、白蠟22號(hào)、白蠟24號(hào)、白蠟26號(hào)、白蠟30號(hào)、白蠟32號(hào)、白蠟36號(hào)共12個(gè)種質(zhì)，其中5個(gè)種質(zhì)來(lái)自黑龍江，4個(gè)種質(zhì)來(lái)自北京，3個(gè)種質(zhì)來(lái)自新疆；第二亞類包括白蠟1號(hào)、白蠟3號(hào)、白蠟5號(hào)、白蠟6號(hào)、白蠟7號(hào)、白蠟9號(hào)、白蠟11號(hào)、白蠟13號(hào)、白蠟15號(hào)、白蠟16號(hào)、白蠟17號(hào)、白蠟19號(hào)、白蠟20號(hào)、白蠟21號(hào)、白蠟23號(hào)、白蠟25號(hào)、白蠟27號(hào)、白蠟28號(hào)、白蠟29號(hào)、白蠟31號(hào)、白蠟33號(hào)、白蠟34號(hào)、白蠟35號(hào)、白蠟37號(hào)、白蠟38號(hào)共25個(gè)種質(zhì)，其中11個(gè)種質(zhì)來(lái)自陜西，9個(gè)來(lái)自山東，4個(gè)來(lái)自甘肅，1個(gè)來(lái)自北京。SSR分子標(biāo)記的聚類結(jié)果與種質(zhì)的緯度空間分布具有一定的相關(guān)性?？梢?jiàn)，SSR分子標(biāo)記在一定程度上反映了種質(zhì)的地理分布特點(diǎn)。

3 討論與結(jié)論

解決白蠟育種和種質(zhì)資源管理方面的問(wèn)題，研究其物種的遺傳多樣性和種質(zhì)間的親緣關(guān)系具有非常重要的意義[19]。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)SSR技術(shù)對(duì)白蠟種質(zhì)SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化和遺傳多樣性分析，前人已有研究報(bào)道，其結(jié)果為平均每對(duì)引物檢測(cè)到3.5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)性信息含量（PIC）平均為0.548 0[14，15]。本研究遴選了15對(duì)多態(tài)性引物對(duì)38份白蠟屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析，所有引物均表現(xiàn)出了多態(tài)性，每對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)2～6個(gè)不等，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出3.8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)；不同位點(diǎn)的PIC值變化范圍為0.625 1～0.917 1，平均PIC值為0.807 7，這一結(jié)果高于前人的研究結(jié)果，可能與所選用的38份白蠟種質(zhì)來(lái)自中國(guó)的中、低緯度不同地區(qū)有關(guān)。黎中寶等[20]曾對(duì)不同緯度地區(qū)的桐花樹(shù)進(jìn)行遺傳多樣性研究，得出的結(jié)論為桐花樹(shù)的親緣關(guān)系與地理因素具有一定的相關(guān)性。

目前很多國(guó)家在林木新品種審定時(shí)都需要DUS證明，用于區(qū)分新品種與已知品種的不同[21，22]。近年來(lái)SSR分子標(biāo)記技術(shù)由于具有簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、共顯性的特點(diǎn)得到廣泛運(yùn)用。本試驗(yàn)采用SSR技術(shù)構(gòu)建了中國(guó)不同緯度地區(qū)38份白蠟種質(zhì)的DNA指紋圖譜，從15對(duì)SSR引物中篩選出5對(duì)Y39、Y55、Y78、Y132和Y149組合可將來(lái)自不同緯度地區(qū)的38份白蠟種質(zhì)完全區(qū)分開(kāi)。隨著白蠟新品種的不斷推出，品種的指紋圖譜還需要不斷加強(qiáng)，這就需要研究者不斷篩選出新的核心引物，為今后新的品種盡可能提供指紋認(rèn)證，只有如此，才可能更好地構(gòu)建種質(zhì)資源保護(hù)、評(píng)價(jià)、推廣、利用的綜合體系建設(shè)[18，23]。

本研究聚類分析結(jié)果顯示，以緯度為分類可將所有種質(zhì)分為2大類，來(lái)自低緯度湖南的聚為一類，而來(lái)自新疆、黑龍江、甘肅、陜西、北京、山東中緯度地區(qū)的白蠟種質(zhì)聚為一類，說(shuō)明緯度因素對(duì)種質(zhì)有很大影響，即種質(zhì)間的親緣關(guān)系與地理來(lái)源有一定的相關(guān)性。來(lái)源緯度相近的黑龍江5個(gè)、北京4個(gè)、新疆3個(gè)種質(zhì)聚為一類；來(lái)源緯度相近的陜西11個(gè)、山東9個(gè)、甘肅4個(gè)、北京1個(gè)種質(zhì)聚為一類。可以看出大部分地理來(lái)源相同的種質(zhì)聚在了同一類群中，但也有少部分不同地理來(lái)源的種質(zhì)聚在同一類群，這可能是由于不同生態(tài)環(huán)境下種質(zhì)資源的基因交流，導(dǎo)致不同生境條件下的種質(zhì)資源的親緣關(guān)系發(fā)生了變化[24-26]。不同種植區(qū)的生態(tài)環(huán)境變化和地區(qū)間產(chǎn)生的基因交流也有利于其遺傳變異的積累和保持。

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