田艷紅，王宏利，郭雅玲，羅改云，高秀梅，闞洪敏

(西安市第八醫(yī)院，西安 710061)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)因惡性腫瘤死亡的人數(shù)約占全部死亡人數(shù)的1/4[1]，其中肝癌高居發(fā)病率的第四位、死因的第三位[2]。依據(jù)細(xì)胞分型，可將原發(fā)性肝癌分為肝細(xì)胞癌(HCC)、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及混合型肝癌，其中以HCC最為常見(jiàn)[3]。影響HCC患者預(yù)后的主要因素之一是腫瘤細(xì)胞對(duì)其他機(jī)體組織的侵襲與轉(zhuǎn)移。目前針對(duì)HCC腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程的研究主要集中于腫瘤細(xì)胞本身，而對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)研究較少。肌腱蛋白家族的主要成員Tenascin-C蛋白，是一種由TNC基因編碼的六聚體糖蛋白，主要表達(dá)于多種機(jī)體組織的細(xì)胞外基質(zhì)中[4]。Tenascin-C蛋白參與調(diào)控細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用[5]，有可能參與HCC的發(fā)生和惡性進(jìn)展過(guò)程。2013年1月～2018年3月，我們應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)Tenascin-C蛋白在HCC患者癌組織中的表達(dá)，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2018年3月我院HCC患者60例，男41例、女19例，年齡25～76(49.32±12.44)歲。患者均于術(shù)后經(jīng)病理科確診為原發(fā)性HCC。納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性HCC，未合并其他種類(lèi)惡性腫瘤；②患者臨床病例資料完整；③術(shù)前未進(jìn)行放、化療等其他抗腫瘤手段治療；④未合并其他嚴(yán)重疾病。HCC組織標(biāo)本由外科手術(shù)取得，均立即常規(guī)石蠟包埋儲(chǔ)存。另選取30例肝硬化組織[肝硬化患者，男19例、女11例，年齡27～74(45.41±10.57)歲，經(jīng)肝穿刺活檢確診]和15例正常肝組織作為對(duì)照[健康志愿者，男9例、女6例，年齡24～72(47.32±11.18)歲]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

1.2 肝癌、肝硬化及正常肝組織中Tenascin-C蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。將石蠟標(biāo)本常規(guī)脫蠟水化，以4 μm間隔連續(xù)切片，于95 ℃沸水浴20 min修復(fù)抗原，室溫沖洗30 min冷卻至室溫，PBS沖洗3次。滴加去離子水孵育10 min，PBS沖洗3次。以常規(guī)山羊血清工作液封閉，孵育15 min。加入一抗Tenascin鼠抗人單克隆抗體(PL Laboratories公司，加拿大)，置于4 ℃冰箱過(guò)夜孵育。次日恢復(fù)至室溫后加入生物素化小鼠二抗(購(gòu)于深圳欣博盛生物科技有限公司)孵育15 min，PBS沖洗3次。滴加辣根過(guò)氧化物酶親和素(購(gòu)于深圳欣博盛生物科技有限公司)，孵育15 min，PBS沖洗3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水。常規(guī)制片，封片。高倍(×400)光學(xué)顯微鏡下取4個(gè)不同陽(yáng)性區(qū)域，觀察Tenascin-C蛋白表達(dá)情況。采用半定量法判定結(jié)果，取4個(gè)區(qū)域結(jié)果的算術(shù)平均數(shù)。將染色結(jié)果分為兩部分：染色強(qiáng)度判定：無(wú)色計(jì)0分，淺黃色至黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，褐色計(jì)3分；染色數(shù)目判定：<5%計(jì)0分，5～30%計(jì)1分，30～75%計(jì)2分，>75%計(jì)3分。將染色結(jié)果與染色數(shù)目相加，0～3分視為陰性表達(dá)，>3分視為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 隨訪 以患者術(shù)后出院為觀察起點(diǎn)，應(yīng)用電話、電子通訊等手段，結(jié)合復(fù)診病歷，對(duì)患者進(jìn)行隨訪調(diào)查。隨訪截止于2018年3月，時(shí)長(zhǎng)9～62(31.02±13.70)個(gè)月。失訪病例已剔除。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier生存曲線法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝組織中Tenascin-C蛋白表達(dá)比較 Tenascin-C蛋白在HCC癌組織、肝硬化組織和正常肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.67%(37/60)、20.00%(6/30)、0(0/15)，三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=26.496，P=0.000)。

2.2 癌組織中Tenascin-C表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系 HCC癌組織中Tenascin-C表達(dá)與門(mén)靜脈侵犯、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡和腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 Tenascin-C表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 HCC癌組織中Tenascin-C表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 Tenascin-C表達(dá)陰性者生存率為56.52%(13/23)，生存時(shí)間為(45.64±3.91)個(gè)月；Tenascin-C表達(dá)陽(yáng)性者生存率為16.22%(6/37)，生存時(shí)間為(28.58±2.36)個(gè)月。Tenascin-C陰性表達(dá)者的術(shù)后生存率和生存時(shí)間均優(yōu)于Tenascin-C陽(yáng)性表達(dá)者(χ2=10.648，P=0.001；t=21.118，P=0.000)。

3 討論

HCC起病初期無(wú)明顯癥狀，一旦出現(xiàn)肝區(qū)腫大、肝區(qū)疼痛及其他明顯全身性癥狀時(shí)，則多數(shù)已進(jìn)入中晚期。目前我國(guó)臨床對(duì)HCC可采取的治療措施有根治性肝切除術(shù)、介入治療、中醫(yī)中藥治療、放射治療、化療、消融治療、靶向治療等[6]。HCC的5年總生存率約20%[7]。一般認(rèn)為接受根治性手術(shù)的HCC患者預(yù)后瓶頸在于HCC轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)[8]，但目前尚無(wú)有效預(yù)防HCC術(shù)后轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的手段。腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)與腫瘤細(xì)胞及其附近的細(xì)胞外基質(zhì)所形成的微環(huán)境密切相關(guān)[9]。腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)有其特殊性，其中的基質(zhì)細(xì)胞與自身的產(chǎn)物具有刺激腫瘤血管生成、增加腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移等作用[10]。

Tenascin-C蛋白是一種廣泛表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白，有可能參與腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，但目前對(duì)于Tenascin-C蛋白在HCC組織中的作用的研究尚不明確。Tenascin-C蛋白的6個(gè)亞基由二硫鍵連接，每個(gè)亞基均含有一個(gè)富含半胱氨酸端，表皮生長(zhǎng)因子基團(tuán)，纖維連接蛋白Ⅲ型結(jié)構(gòu)域及一個(gè)類(lèi)纖維蛋白原C基末端[11]，從而形成一種多域結(jié)構(gòu)。Tenascin-C蛋白的多域結(jié)構(gòu)使其能與多種蛋白發(fā)生相互作用，從而參與機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞增殖、黏附、遷移與分化[12]。Tenascin-C蛋白在胎兒的正常發(fā)育過(guò)程中表達(dá)較高，在胚胎成型過(guò)程中起重要作用[13]。Tenascin-C蛋白在正常的成熟組織中表達(dá)較低，而Tenascin-C表達(dá)上調(diào)多提示感染、炎癥甚至腫瘤等病理進(jìn)程的出現(xiàn)[14]。近期，Wang等[15]通過(guò)研究動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞的Tenascin-C表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Tenascin-C能通過(guò)annexin Ⅱ蛋白調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫表型，同時(shí)促血管生成。Murakami等[16]通過(guò)檢測(cè)大腸癌基質(zhì)中Tenascin-C表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Tenascin-C在大腸癌基質(zhì)中的表達(dá)升高，且可能是部分微小RNA的作用靶點(diǎn)，從而參與大腸癌的肝轉(zhuǎn)移進(jìn)程。San等[17]發(fā)現(xiàn)，骨內(nèi)膜細(xì)胞基質(zhì)中Tenascin-C表達(dá)與前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)Tenascin-C在正常肝組織中未出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，而在HCC組織中異常高表達(dá)，而肝硬化組織中Tenascin-C表達(dá)雖較HCC組織低，仍較正常肝組織有所升高。因此推斷肝組織中Tenascin-C表達(dá)與前述其他組織中相似，即肝組織中Tenascin-C表達(dá)異常可提示機(jī)體肝臟出現(xiàn)炎癥、感染、腫瘤等異常情況，Tenascin-C可能參與了肝組織中多種異常病理進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示，HCC組織中Tenascin-C表達(dá)與門(mén)靜脈侵犯、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示Tenascin-C在HCC組織中所起作用與前述腫瘤相關(guān)研究類(lèi)似，即Tenascin-C能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力，提高腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能。對(duì)術(shù)后患者的隨訪調(diào)查結(jié)果顯示，Tenascin-C表達(dá)陽(yáng)性者普遍預(yù)后較差，5年總生存率不足20%，因而可將Tenascin-C表達(dá)陽(yáng)性視為HCC患者不良預(yù)后的標(biāo)志。

綜上所述，Tenascin-C在HCC組織中的表達(dá)異常升高，Tenascin-C可能參與了HCC的發(fā)生和惡性進(jìn)展。Tenascin-C表達(dá)陽(yáng)性者預(yù)后較差，需加強(qiáng)監(jiān)控，術(shù)后合理結(jié)合輔助抗腫瘤手段，以延長(zhǎng)患者生存時(shí)間，提高生存率。