楊琳紅，王維峰，張淑紅，范宗憲，魏曉麗，李江華

(1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154000;2佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

鼻息肉是耳鼻喉科常見(jiàn)的鼻腔良性增生性病變，目前，手術(shù)切除仍是鼻息肉的主要治療手段，然而高達(dá)15%～40%的患者存在術(shù)后復(fù)發(fā)[1]。鼻息肉的形成機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，大量研究結(jié)果顯示，鼻息肉形成與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子、變態(tài)反應(yīng)、免疫應(yīng)答及環(huán)境因素等密切相關(guān)[2]。近年來(lái)，鼻黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖與凋亡在鼻息肉形成和發(fā)展中的作用，逐漸成為研究熱點(diǎn)。微小RNA(microRNAs)是由18～25個(gè)核苷酸組成的非編碼小RNA分子，參與調(diào)節(jié)多種機(jī)體生理病理過(guò)程，如胚胎發(fā)育、新陳代謝、免疫應(yīng)答及腫瘤形成和發(fā)展等[3]。microRNAs具有作為疾病診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)的潛能[4]，如miR-125b在喉鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，且參與細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程，可作為治療靶標(biāo)[5]；而在HER2陽(yáng)性乳腺癌中，miR-125b表達(dá)升高，且其高表達(dá)預(yù)示患者不良預(yù)后[6]。目前關(guān)于miR-125b功能的研究結(jié)論不一。2016年1～12月，我們研究miR-125b在鼻息肉上皮細(xì)胞中表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并初步探討其機(jī)制，以期為鼻息肉的早期干預(yù)及治療提供理論基礎(chǔ)和新思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本、試劑與儀器 收集2016年1～12月入住佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院的30例鼻息肉患者的鼻息肉樣本，患者男19例、女11例，年齡16～55(41.36±5.59)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次鼻息肉切除術(shù)；術(shù)前2周未使用糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥物。選擇同期行單純鼻中隔矯正手術(shù)的16例患者的正常下鼻甲樣本，患者男9例、女7例，年齡15～43(27.68±4.67)歲，兩組性別、年齡間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。樣本采集經(jīng)患者知情同意，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。試劑：膠原酶Ⅳ、DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗溶液(青霉素+鏈霉素)和0.25%胰酶溶液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TRIzol溶液、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，real-time PCR引物、miR-125b mimics和無(wú)關(guān)對(duì)照序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成，Lipofectamine?3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，RIPA裂解液、BCA試劑盒和ECL發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗體PI3KCD(ab151549)、Akt(ab64148)、p-Akt(ab18785)和GAPDH(ab9485)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)自艾美捷科技有限公司。儀器：二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo HERAcell 150i/240i)，低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific Fresco 17)，微量組織研磨器(美國(guó)Kimble 749540-0000)，超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific NanoDrop 2000C)，定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems 7500)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek ELx800)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD FACSCanto Ⅱ)。

1.2 細(xì)胞原代培養(yǎng) 術(shù)中切取鼻息肉，預(yù)冷無(wú)菌PBS緩沖液反復(fù)沖洗；無(wú)菌剪將組織剪碎后，加入適量1%膠原酶Ⅳ，吹打后，置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化30 min；吹打消化后的組織，棄去塊狀組織；4 ℃，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/L青霉素和100 ng/mL鏈霉素)，吹打混勻后，接種于培養(yǎng)皿中，置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3 鼻息肉及下鼻甲組織中miR-125b相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。取鼻息肉和下鼻甲組織，切取適量，按100 mg/mL加入TRIzol溶液，微量組織研磨器進(jìn)行充分勻漿，參照TRIzol法提取RNA試驗(yàn)步驟，提取組織樣本中總RNA，超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度后，取0.8 μg RNA，參照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的反應(yīng)體系(20 μL體系)和反應(yīng)條件，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照real-time PCR試劑盒的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件(95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)35次)，定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。real-time PCR引物序列如下，miR-125b正向引物：5′-GCUCCCUGAGACCCUAAC-3′,反向引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′，以U6為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法計(jì)算miR-125b相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 鼻息肉上皮細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液中，呈貼壁生長(zhǎng)，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，隨機(jī)分為mimics組、NC組和空白對(duì)照組，mimics組、NC組采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000分別將miR-125b模擬物(miR-125b mimics)和無(wú)關(guān)對(duì)照序列(NC)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，空白對(duì)照組未進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4～6 h后，更換培養(yǎng)液。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)12 h后，0.25%胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，接種于96孔板中(約8×104個(gè)細(xì)胞/100 μL/孔)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，0、24、48、72 h時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h后，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度值。獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，0.25%胰酶(不含EDTA)消化，預(yù)冷PBS緩沖液洗滌2次，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL，取細(xì)胞懸液100 μL，加入PI 5 μL和Annexin V-FITC染料5 μL，輕輕吹打混勻后，避光室溫孵育15 min，加入Binding Buffer 400 μL，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 鼻息肉上皮細(xì)胞中PI3KCD、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h后，收集約1×106個(gè)細(xì)胞，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取20 μg蛋白，加入相應(yīng)體積上樣緩沖液，沸水煮沸變性5 min，SDS-PAGE膠分離后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5% BSA溶液(PBS緩沖液溶液配制)室溫孵育1 h后，分別加入PI3KCD、Akt、p-Akt和GAPDH一抗工作液(PBS緩沖液溶液配制，稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBST溶液(0.1%)洗滌3次后，分別加入對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗工作液(PBS緩沖液溶液配制，稀釋比例均為1∶5 000)，室溫孵育1 h，PBST溶液(0.1%)洗滌3次后，ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色反應(yīng)，以目的基因條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值的比值，表示目的基因的蛋白相對(duì)表達(dá)量。獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-125b在鼻息肉及正常下鼻甲組織中表達(dá)比較 miR-125b在鼻息肉、正常下鼻甲樣本中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.39±0.12、1.16±0.24，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-9.700，P=0.000)。

2.2 miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)鼻息肉上皮細(xì)胞增殖的影響 CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，mimics組細(xì)胞增殖能力與NC組和空白對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，mimics組細(xì)胞增殖能力低于NC組(t=-4.374，P=0.006)和空白對(duì)照組(t=-4.014，P=0.008)，NC組和空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.244，P=0.410)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，mimics組細(xì)胞增殖能力低于NC組(t=-2.540，P=0.032)和空白對(duì)照組(t=-2.739，P=0.026)，NC組和空白對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.294，P=0.392)，見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值比較±s)

注：與同時(shí)點(diǎn)NC組和空白對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.3 miR-125b過(guò)表達(dá)對(duì)鼻息肉上皮細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，mimics組、NC組、空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為21.35%±2.65%、9.16%±1.88%、8.95%±2.04%，mimics組與NC組、空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.498，P=0.001；t=6.422，P=0.002)，NC組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.131，P=0.451)。

2.4 各組細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較 mimics組細(xì)胞中PI3KCD蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于NC組和空白對(duì)照組(t=-7.464，P=0.001；t=-7.710，P=0.001)，NC組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.008，P=0.185)；mimics組細(xì)胞中p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于NC組和空白對(duì)照組(t=-5.035，P=0.004；t=-4.181，P=0.007)，NC組和空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.500，P=2.132)，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與NC組和空白對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

鼻息肉是一種特殊類型的慢性鼻-鼻竇炎，又名為慢性鼻-鼻竇炎伴息肉，以鼻黏膜在鼻竇和鼻腔形成息肉為主要特點(diǎn)，是臨床常見(jiàn)的鼻腔和鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病[7]。流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國(guó)一般人群中鼻息肉的發(fā)病率約4%，且復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[8]。目前，鼻息肉的形成機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，近年來(lái)有研究報(bào)道稱，在鼻息肉形成過(guò)程中，局部鼻黏膜上皮細(xì)胞受到多種內(nèi)在及外在病理因素的長(zhǎng)期刺激，引起細(xì)胞纖維化、水腫及異常增殖，進(jìn)而導(dǎo)致上皮細(xì)胞受損及組織異常重塑，形成鼻息肉[9]。細(xì)胞增殖和凋亡是維持內(nèi)環(huán)境平衡的關(guān)鍵，是生物體重要的生命特征。鼻息肉作為一種炎性增生型疾病，上皮細(xì)胞的增殖和凋亡平衡失調(diào)可能是導(dǎo)致鼻息肉形成及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。鼻息肉具有可增殖復(fù)發(fā)但無(wú)癌變的特征，目前，關(guān)于促癌基因與抑癌基因、增殖與凋亡基因在鼻息肉等炎性增生型疾病中研究日益增多[10]。

研究證實(shí)，miR-125b可同時(shí)具有抑癌基因和促癌基因功能，如在急性髓系白血病中，miR-125b具有抑癌基因功能，可抑制細(xì)胞增殖侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]，而在非小細(xì)胞肺癌中，miR-125b則發(fā)揮促癌基因功能，其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞侵襲并導(dǎo)致患者預(yù)后不良[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-125b在鼻息肉樣本中的相對(duì)表達(dá)量低于正常下鼻甲樣本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在鼻息肉形成過(guò)程中miR-125b可能發(fā)揮抑制作用。隨后，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，在鼻息肉上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-125b后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖被顯著抑制，且細(xì)胞凋亡明顯增加，提示miR-125b高表達(dá)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖作用，而miR-125b在鼻息肉中表達(dá)降低，由此推測(cè)，miR-125b低表達(dá)可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)鼻息肉形成。陳丹等[13]研究結(jié)果亦證實(shí)，在鼻息肉形成、生長(zhǎng)、新腺體形成等過(guò)程中，鼻黏膜上皮細(xì)胞過(guò)度增殖及凋亡減少發(fā)揮了重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，增加鼻息肉上皮細(xì)胞中miR-125b表達(dá)后，細(xì)胞中PI3KCD蛋白水平降低，PI3KCD(即PI3K delta亞基)是PI3K的重要亞基，在腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要功能[14]。PI3K活化后可催化磷酸化磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸(PIP2)磷酸化為PIP3，進(jìn)而激活A(yù)kt及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究中增加鼻息肉上皮細(xì)胞中miR-125b表達(dá)后，細(xì)胞中p-Akt蛋白水平降低，提示過(guò)表達(dá)miR-125b可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性，miR-125b是PI3K/Akt信號(hào)通路活性的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Cui等[15]研究結(jié)果證實(shí)，miR-125b通過(guò)靶向調(diào)節(jié)PI3KCD基因表達(dá)，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和黏附等生物過(guò)程中均占重要地位[16]，本研究并未對(duì)miR-125b調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路活性的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，后續(xù)將進(jìn)一步探究。此外，研究證實(shí)，鼻息肉形成與發(fā)展過(guò)程中存在多種細(xì)胞增殖、凋亡基因的異常表達(dá)，如Fas/FasL[17]、Bax/Bcl-2[18]及Ki-67[19]等。本研究將在后續(xù)研究中關(guān)注其他增殖、凋亡基因在鼻息肉上皮組織中的表達(dá)及機(jī)制。

綜上所述，miR-125b在鼻息肉中低表達(dá)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在鼻息肉形成與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。