孫大宇，單德紅，劉旭東，劉文俊，王德山

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)生理教研室，沈陽110847)

脾的運化功能一定程度上取決于小腸上皮細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運能力，其動力與小腸上皮細胞線粒體氧化呼吸鏈的功能密切相關(guān)。1976年，Nicholls首次發(fā)現(xiàn)能介導(dǎo)質(zhì)子漏的蛋白并命名為解偶聯(lián)蛋白(UCP)[1]。UCPs家族單蛋白表達部位不盡相同，其中UCP2表達廣泛，如在白色脂肪組織、脾、腎、胰島、肺及腦部多種組織中均有表達，胃腸道亦有表達[2]。目前認為，UCP2的主要功能是調(diào)控ATP合成，清除線粒體內(nèi)的氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的氧自由基ROS，質(zhì)子通道作用等[3～5]。UCP2作為底物可直接被環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)-信息沉默調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)信號通路活化而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6～10]。本實驗通過觀察附子理中丸對脾陽虛大鼠小腸上皮細胞CREB、Sirt1、UCP2表達和ATP合成的影響，旨在為“脾主運化”理論的外周性調(diào)控機制研究提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 SPF級SD雄性大鼠40只，7～8周齡，體質(zhì)量(220±10)g。Rabbit-anti-rat UCP2一抗10 μL(美國Santa Cruz公司,稀釋倍數(shù)1∶200)，Rabbit-anti-rat CREB一抗10 μL(美國Santa Cruz公司,稀釋倍數(shù)1∶200)，Mouse-anti-rat SIRT1一抗5 μL(美國Abcam公司，稀釋倍數(shù)：1∶1 000)。組織線粒體分離試劑盒、100 mmol/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司南通分公司)，PBS緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.4)，檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L、pH6.0)，蛋白酶抑制劑(美國 Sigma 公司),TRIzol裂解液(美國 Invitrogen公司)。Bio-Rad iMark酶標儀(美國伯樂，波長范圍400～750 nm)，PCR擴增儀(TP650 德國Biometra公司)，SDS-PAGE儀(APC300，美國BIO-RAD公司)，垂直電泳槽(Mini RPOTEANII cell，美國BIO-ARD公司),數(shù)字型可調(diào)移液器(100～1 000 μL，美國熱電公司)，圖像分析系統(tǒng) (美國 UVP)等。

1.2 動物分組及模型復(fù)制 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層后，按隨機數(shù)字表法分為4組：空白對照組(空白組)、脾陽虛模型組(模型組)、附子理中丸治療組(中藥組)、脾陽虛自然恢復(fù)組(自愈組)，每組10只?？瞻捉M不施加任何干預(yù)因素。模型組：采用飲食失節(jié)+勞倦等復(fù)合因素方法，即飽食1 d，禁食2 d，每日游泳至力竭，連續(xù)2周，復(fù)制脾氣虛模型，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用“苦寒瀉下”法，通過灌服100%番瀉葉，1 mL/100 g，2次/d，連續(xù)2周，復(fù)制脾陽虛模型。中藥組和自愈組按模型組方法復(fù)制動物模型。模型建立后，中藥組給予附子理中丸1∶1水溶液灌胃，給藥量2 mL/(100 g·d)，連續(xù)2周。模型評價標準采用主癥+次癥法[11,12]。

1.3 小腸上皮黏膜細胞中CREB、 Sirt1及線粒體UCP2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。各組大鼠于實驗第43天禁食24 h后取材，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉，常規(guī)開腹，剪取十二指腸下3 cm處腸管組織，迅速于4 ℃生理鹽水中清洗，至于冰袋上無菌濾紙上吸干多余水分，眼科剪縱向剪開腸管，用醫(yī)用無菌棉簽輕拭腸腔表面，用無菌載玻片輕輕刮取黏膜層組織約100 mg，置于冷存管中液氮冷凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存。應(yīng)用組織線粒體分離試劑盒提取線粒體蛋白。用眼科剪輕輕剪碎EP管中標本，加入10倍體積預(yù)冷的線粒體分離試劑A，在添加線粒體分離試劑A前數(shù)分鐘內(nèi)先加入適量的PMSF溶液，使其終濃度達到1 mmol/mL。在冰浴上高速勻漿機研磨2 min，低溫低速離心機600 r/min，4 ℃離心5 min。將上清液移至另一個無菌EP管中，低溫高速離心機11 000 r/min，4 ℃離心10 min，管中沉淀即為所獲得的線粒體。再次將上清液移至新的EP管中，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，提取上清至新的EP管中，即獲得細胞胞質(zhì)蛋白。對獲得的線粒體加入150～200 mL線粒體裂解液進行裂解。按照試劑盒說明書操作，酶標儀波長562 nm測定96孔板各空的吸光值；根據(jù)標準品濃度繪制標準曲線，并計算出樣本蛋白濃度，將樣本調(diào)整為統(tǒng)一標準濃度備用。各組分別取樣品15 μL進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；冰浴，30 V，2 h恒壓轉(zhuǎn)膜至硝基纖維膜；1×TBS洗膜5 min，2次；用5%Milk-PBST，室溫、振蕩封閉過夜。分別加入Rabbit-anti-rat UCP2一抗10 μL，Rabbit-anti-rat CREB一抗10 μL，Mouse-anti-rat SIRT1一抗5 μL，4 ℃過夜。TTBS洗膜，5 min，3次；室溫下加入小鼠及兔來源的二抗(稀釋倍數(shù)分別是1∶1 000和1∶500) 搖床孵育2 h；TTBS洗膜5 min，3次。超敏發(fā)光液ECL顯色，圖像分析系統(tǒng)分析，并計算蛋白相對表達量。

1.4 小腸上皮黏膜細胞中CREB、Sirt1 mRNA及線粒體UCP2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取凍存標本(≤30 mg)，使用眼科剪剪碎小腸組織后，TRIzol法提取組織總RNA，按常規(guī)方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×Primer Script Buffer，6 μL；Oligo dT Primer(50 μmol/L)，1 μL；Random 6 mers(100 μmol/L)，1 μL；Primer Script RT Enzyme Mix I，1 μL；Total RNA，5 μL；RNase Free Water，總體積加至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。應(yīng)用Primer 5.0軟件，根據(jù)被選基因序列設(shè)計引物(引物由大連寶生物工程公司合成)，以β-actin作為Real-time PCR的內(nèi)參照，引物序列：CREB正向引物：5′-CAGATTGCCACATTAGCCC-3′，反向引物：5′-TTCCCTGTTCTTCATTAGACG-3′；Sirt1正向引物：5′-ATGACAGAGCATCACACGCA-3′，反向引物：5′-TGGCTTGAGGATCTGGGAGA-3′；UCP2正向引物：5′-CAAGCGGAGGAAGGAAGG-3′，反向引物：5′-CAATGTTGCCCGAAATGC-3′；β-actin正向引物：5′-TGCCGCATCCCTCTTCCTC-3′，反向引物：5′-CTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′。Real-time PCR反應(yīng)體系：SYBR Green I，10 μL；Forword primer (10 μmol/L)，0.4 μL；Reverse primer (10 μmol/L)，0.4 μL；DyeⅡ，0.4 μL；模板(cDNA)，2 μL；ddH2O，總體積加至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性，3 min；94 ℃變性，45 s；56.8 ℃退火，45 s；72 ℃延伸，45 s，共35個循環(huán)，72 ℃再延伸7 min終止反應(yīng)，4 ℃保存。每個反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔，并使用等量的cDNA。相對定量采用ΔΔCT法，首先應(yīng)分別測定目的基因和參比基因的量，再求出對于參比基因的目的基因相對量，然后再進行樣品間相對量的比較。

1.5 小腸上皮組織中ATP含量檢測 采用免疫熒光法。按照0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmol/L濃度梯度，將ATP標準溶液用ATP檢測裂解液進行相應(yīng)稀釋。在96T板上設(shè)置標準品孔、空白孔和樣品檢測，各孔分別加100 μL ATP檢測工作液，室溫靜置3～5 min，降低本底對實驗結(jié)果的影響。在各孔內(nèi)加上20 μL標準品或樣品，迅速用微量移液器混勻，至少間隔2 s后，使用多功能酶標儀Luminometer模式，562 nm波長處測定各孔RUL值，通過標準曲線建立回歸方程，計算各孔ATP含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠小腸上皮黏膜細胞CREB、Sirt1及線粒體UCP2蛋白表達比較 見表1。

表1 各組大鼠小腸上皮黏膜細胞CREB、Sirt1和線粒體UCP2蛋白含量比較(n=6)

注：與空白組相比，*P<0.01,**P<0.05,與模型組相比，#P<0.05,##P<0.01；與中藥組相比，△P<0.05,△△P<0.01。

2.2 各組大鼠小腸上皮黏膜細胞CREB、Sirt1及線粒體UCP2 mRNA表達比較 見表2。

表2 各組大鼠小腸上皮黏膜細胞CREB、Sirt1和線粒體UCP2 mRNA表達比較(n=10)

注：與空白組相比，*P<0.01；與模型組相比，#P<0.01；與中藥組相比，△P<0.05,△△P<0.01。

2.3 各組大鼠小腸組織中ATP含量比較 空白組、模型組、中藥組、自愈組大鼠小腸組織中ATP含量分別為(266.38±10.16)、(182.25±11.32)、(249.72±12.68)、(188.65±10.76)nmol/L，與空白組相比，模型組、自愈組大鼠小腸組織中ATP含量降低(P均<0.01)。與模型組相比，中藥組大鼠小腸組織中ATP含量升高(P<0.01)；與中藥組相比，自愈組大鼠小腸組織中ATP含量降低(P<0.01)。

3 討論

脾陽虛證常表現(xiàn)為以脾失健運，溫煦不足，推動和輸布無力所導(dǎo)致的食少納呆、腹脹或時脹時減、少氣懶言、體倦乏力、大便清稀、四肢不溫、周身水腫、舌淡苔白、脈弱等臨床體征。同時，機體的生理活動依賴于對外界攝取的營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、轉(zhuǎn)運和體內(nèi)的能量代謝過程。如果消化吸收功能障礙，必然導(dǎo)致機體能量合成和代謝紊亂。因此，脾陽虛證的發(fā)生可能與小腸消化、吸收和轉(zhuǎn)運營養(yǎng)物質(zhì)的細胞功能障礙密切相關(guān)。

信息沉默調(diào)節(jié)因子(Sirt1)屬于Sirtuin家族，是一種NAD+依賴的組蛋白去乙?；竅13]。Sirt1作為核基因參與體內(nèi)眾多生理功能的調(diào)節(jié)，在糖代謝、脂代謝、胰島素分泌等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。其活化后蛋白通過“核穿梭”進入細胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。周曦等[14]研究發(fā)現(xiàn)，通過活化Sirt1抑制UCP2表達進而減少細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可能是細胞抗氧化應(yīng)激損傷的分子生物學(xué)機制之一。Lilia等[7]研究發(fā)現(xiàn)，禁食可誘導(dǎo)實驗動物肝臟、肌肉、白色脂肪和褐色脂肪組織中Sirt1的表達升高，這一變化由cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)協(xié)同調(diào)控而實現(xiàn)。同時近期研究表明Sirt1蛋白亦存在多種磷酸化位點[15]，其轉(zhuǎn)錄和活性亦受到翻譯后修飾的調(diào)控。因此，Sirt1的活化與CREB表達和磷酸化水平有關(guān)，進而調(diào)控了UCP2表達而引發(fā)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。

本實驗研究結(jié)果表明，模型組大鼠小腸黏膜上皮細胞CREB和Sirt1蛋白含量和mRNA表達均低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而UCP2表達上調(diào)，組織中ATP含量減少，提示脾陽虛狀態(tài)下，由于小腸黏膜上皮細胞CREB蛋白表達下調(diào)，使CREB磷酸化活性降低，導(dǎo)致Sirt1蛋白和基因表達抑制，進而導(dǎo)致Sirt1對線粒體UCP2的抑制作用降低，使后者出現(xiàn)過表達而引發(fā)線粒體氧化呼吸量解耦聯(lián)，降低了ATP合成，使小腸上皮細胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運能力下降。與模型組相比，中藥組大鼠小腸黏膜上皮細胞CREB與Sirt1蛋白含量和mRNA表達明顯上升，UCP2蛋白表達減少，組織中ATP含量增加，提示附子理中丸治療脾陽虛證作用可能與改善CREB-Sirt1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，下調(diào)線粒體UCP2蛋白表達，促進線粒體ATP合成有關(guān)。自愈組大鼠小腸黏膜上皮細胞CREB、Sirt1蛋白含量和mRNA表達變化與模型組相似，且明顯低于中藥組，UCP2表達高于中藥組，組織中ATP含量明顯低于中藥組，提示其由于小腸黏膜上皮細胞CREB-Sirt1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能抑制而致線粒體UCP2過表達引起ATP合成減少的機制依然存在，導(dǎo)致其宏觀表征并未出現(xiàn)明顯改觀。

脾陽虛狀態(tài)下，由于小腸組織中CREB-Sirt1信號通路的活性下調(diào)，引起線粒體UCP2蛋白表達上調(diào)，導(dǎo)致線粒體氧化呼吸鏈解耦聯(lián)，引起能量合成障礙，使小腸上皮細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能受抑，進而導(dǎo)致機體營養(yǎng)物質(zhì)吸收動力不足，表現(xiàn)為脾氣虛衰，脾失健運，其運化水谷、轉(zhuǎn)輸精微、統(tǒng)攝血液的功能減退，出現(xiàn)食少納呆、腹脹或時脹時減、少氣懶言、體倦乏力之征。因此，小腸上皮細胞CREB-Sirt1介導(dǎo)的UCP2蛋白表達上調(diào)和ATP合成減少，參與了脾陽虛消化吸收功能的外周性抑制過程。