葉泉英，林浩佳，陳金慧，彭政，陳啟生

(1佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，廣東佛山528000；2南海人民醫(yī)院)

肝臟是人體的中心代謝器官，肝硬化患者因肝功能低下，導(dǎo)致糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。隨著我國嗜酒人群的不斷擴(kuò)大，酒精性肝病的患病率已躍升至第二位而僅次于病毒性肝炎[1]。相當(dāng)數(shù)量的慢性酒精性肝病患者反復(fù)發(fā)病，久治不愈，最終可遷延為肝硬化、門脈高壓、肝癌等終末期肝病。多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，酒精性肝損傷多伴隨胰島素抵抗，且隨著肝損傷的加重，胰島素抵抗現(xiàn)象更明顯[2,3]。相關(guān)研究表明，熊果酸是存在于天然植物中的一種三萜類化合物，具有鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗?jié)?、降低血糖等多種生物學(xué)效應(yīng)，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能[4～7]。我們通過乙醇灌胃建立大鼠急性肝損傷模型，探討熊果酸對(duì)乙醇所致大鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性清潔級(jí)SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng))32只，7～8周齡，體質(zhì)量300～400 g。熊果酸(美國Axygen公司)，50%乙醇(美國Amresco公司)，聯(lián)苯雙酯(美國TargetMol公司)，10%甲醛溶液(上?？道噬锕?，二甲苯(上海鈺博生物公司)，各濃度乙醇(上?？道噬锕?，蘇木精染液(美國Sigma公司)，伊紅染液(美國Sigma公司)，大鼠SOD檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒(中國HZBscience公司)，血糖檢測(cè)儀(美國通用公司)，全自動(dòng)生化分析儀(美國通用公司)，石蠟切片機(jī)(美國Thermo公司)。

1.2 模型建立及分組 選擇SD大鼠32只，在恒溫且光照通風(fēng)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)。1周后隨機(jī)將其分為4組：對(duì)照組、模型組、熊果酸組及聯(lián)苯雙酯組。每隔3 d稱重。前2周，模型組、熊果酸組及聯(lián)苯雙酯組均隔天以50%乙醇灌胃1次?？瞻捉M不進(jìn)行任何處理。后2周，對(duì)照組及模型組均隔天鹽水灌胃1次，熊果酸組以熊果酸60 mg/kg隔天灌胃1次，聯(lián)苯雙酯組予聯(lián)苯雙酯隔天灌胃1次，給藥量為5.625 mg/kg。末次灌胃后，大鼠禁食24 h。

1.3 樣本采集 給藥后每組大鼠均每隔3 d針刺尾部，應(yīng)用血糖檢測(cè)儀檢測(cè)空腹末梢血糖。至第14天，眼眶取血，放入1.5 mL無菌離心管中，4 ℃條件下1 000 r/min離心15 min，分離上層血清。取上清于-20 ℃冰箱保存，備用。斷頸處理大鼠，剖取肝臟稱重，隨即泡入10%中性甲醛溶液，放于-20 ℃冰箱保存，備用。

1.4 生化指標(biāo)的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)后2周各組大鼠完成給藥后禁食24 h，處理大鼠分離血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(FPG)、血清胰島素(FINS)、胰島素敏感指數(shù)(ISI)、ALT、AST、GGT、TG，應(yīng)用專用試劑盒檢測(cè)大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)活性。

1.5 大鼠肝臟組織石蠟切片制備及病理切片觀察 ①固定與取材：使用10%中性甲醛溶液固定SD大鼠的肝臟組織，24 h后分別從縱斷面取材，修整成1 cm2左右，厚2 mm，隨后流水沖洗8 h。②梯度脫水和透明：50%、75%乙醇6 h，85%乙醇3 h，95%、100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ)乙醇1 h，然后用二甲苯(濃度為50%)浸泡0.5 h，全過程約18 h。適當(dāng)輕微振蕩或晃動(dòng)組織塊。③石蠟包埋：分別于52 ℃軟蠟、52 ℃軟蠟、56 ℃硬蠟各放置1 h。④切片：切去組織周圍過多石蠟，固定于底座上，切片厚約5 μm，50 ℃水浴中展開后立即放入37 ℃烤箱中1 h。⑤脫蠟：二甲苯(Ⅰ)浸泡10 min，二甲苯(Ⅱ)浸泡5 min，100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ)、95%(Ⅰ)、95%(Ⅱ)乙醇各浸泡5 min，85%乙醇浸泡3 min，75%乙醇浸泡2 min，蒸餾水沖洗1 min。⑥染色與脫水：蘇木精染色5 min，自來水沖洗15 min；75%、85%乙醇各浸泡2 min，0.5%伊紅染色1 min，95%(Ⅰ)、95%(Ⅱ)、100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ)乙醇、二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)各浸泡5 min。⑦封片：在二甲苯尚未干透前，將中性樹膠滴加于組織上，從一端逐步蓋下蓋玻片，室溫保存。40倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝組織形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體征、體質(zhì)量變化 在為期4周的實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組大鼠生長(zhǎng)情況良好，毛色光亮，活動(dòng)量及進(jìn)食量正常，表現(xiàn)活潑，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。體質(zhì)量基本穩(wěn)步上升，喂養(yǎng)至最后1周，平均體質(zhì)量較初時(shí)增重71 g。在前2周乙醇灌胃建模期間，模型組、熊果酸組和聯(lián)苯雙酯組大鼠均逐漸出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)量明顯減少，行動(dòng)遲緩，毛色略黃，伴少量掉毛，腹脹，食量下降，增重緩慢。后2周給藥期間，熊果酸組和聯(lián)苯雙酯組大鼠生長(zhǎng)情況有所好轉(zhuǎn)，毛色日漸恢復(fù)光亮，掉毛量減少，活動(dòng)量及進(jìn)食量增多，行動(dòng)、反應(yīng)能力明顯較前增強(qiáng)，腹脹逐漸消降，體質(zhì)量升高幅度均較造模期間要高。熊果酸組和聯(lián)苯雙酯組大鼠平均體質(zhì)量較初時(shí)分別增重50 g和36 g。而模型組大鼠生長(zhǎng)情況無明顯改善，行動(dòng)、反應(yīng)能力越發(fā)遲緩，腹部較前腫脹，體質(zhì)量增幅緩慢，平均體質(zhì)量較初時(shí)僅增重20 g(圖1)。

圖1 飼養(yǎng)期間各組大鼠體質(zhì)量變化

2.2 大鼠給藥后末梢FPG變化 在為期4周的實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組大鼠末梢FPG平穩(wěn)，波動(dòng)在4.8～5.1 mmol/L。在前2周乙醇灌胃建模期間，模型組、熊果酸組和聯(lián)苯雙酯組大鼠末梢FPG出現(xiàn)明顯升高，且升高幅度基本一致。后2周給藥期間，熊果酸組和聯(lián)苯雙酯組大鼠末梢FPG在給藥后出現(xiàn)短暫平臺(tái)期，之后均有所下降，波動(dòng)在5.2～5.5 mmol/L。而模型組大鼠末梢FPG則持續(xù)升高，至喂養(yǎng)末期達(dá)到7.6 mmol/L(圖2)。

圖2 飼養(yǎng)期間各組大鼠末梢FPG變化

2.3 大鼠肝臟及病理切片表現(xiàn) 鏡下觀察各組大鼠的肝組織形態(tài)有明顯差異?？梢妼?duì)照組大鼠肝小葉中央靜脈周圍有呈放射狀排列的肝細(xì)胞包繞。肝板間有不規(guī)則的肝血竇，匯向中央靜脈。肝小葉內(nèi)的網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)無明顯膠原纖維存在，其周圍無炎癥細(xì)胞浸潤。模型組大鼠的肝組織可見肝細(xì)胞排列紊亂，胞質(zhì)腫脹，小葉周邊部界板肝細(xì)胞的灶性壞死和崩解，匯管區(qū)擴(kuò)大，有膠原沉積，膠原纖維延伸成纖維間隔，有淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤。熊果酸組和聯(lián)苯雙酯組大鼠的肝臟組織相似，接近于對(duì)照組，肝小葉結(jié)構(gòu)保持大致正常，未見明顯纖維變性，匯管區(qū)無擴(kuò)大，但有少量炎癥細(xì)胞浸潤。

2.4 熊果酸對(duì)大鼠血糖的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠FPG升高(P<0.001)，血清FINS降低(P<0.001)，ISI降低(P<0.001)。熊果酸組及聯(lián)苯雙酯組大鼠FPG及血清FINS水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。熊果酸組及聯(lián)苯雙酯組與模型組比較，大鼠FPG水平下降(P均<0.001)，血清FINS水平升高(P均<0.001)，見表1。

2.5 熊果酸對(duì)大鼠肝功能的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠ALT、AST、GGT、TG均升高(P均<0.005)。熊果酸組及聯(lián)苯雙酯組ALT、AST、GGT、TG水平接近對(duì)照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。熊果酸組及聯(lián)苯雙酯組ALT、AST、GGT、TG水平與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠FPG、血清FINS、ISI比較(n=8,±s)

注：與對(duì)照組相比,aP<0.001；與模型組相比，bP<0.001。

表2 各組大鼠肝功能指標(biāo)比較(n=8，±s)

注：與對(duì)照組相比,aP<0.001，bP<0.005；與模型組相比，cP<0.001。

2.6 各組大鼠SOD、MAD水平比較 與對(duì)照組相比，模型組SOD活性降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)。熊果酸組及聯(lián)苯雙酯組SOD、MDA含量與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。熊果酸組及聯(lián)苯雙酯組SOD、MDA含量與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001)，見表3。

表3 各組大鼠SOD、MAD水平比較 (n=8，±s)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05;與模型組相比,cP<0.001。

3 討論

肝臟是人體內(nèi)最大的消化腺，在病毒、化學(xué)物質(zhì)、體內(nèi)應(yīng)激等因素的刺激下可導(dǎo)致肝臟損傷，其特點(diǎn)是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥、壞死和凋亡，星狀細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞被激活并分泌促進(jìn)肝臟纖維化的細(xì)胞外基質(zhì)，在這一過程中可能引起肝臟內(nèi)結(jié)構(gòu)重建，嚴(yán)重者可使肝損傷持續(xù)，最終導(dǎo)致一系列肝臟疾病，如肝衰竭、肝硬化，直至肝癌。眾所周知，肝臟是乙醇代謝的重要場(chǎng)所，長(zhǎng)期飲酒或短時(shí)間大量飲酒可引起慢性或急性酒精性肝損傷[8]。有研究表明，急性酒精性肝損傷的病因主要是大量攝入乙醇后其代謝產(chǎn)物引起的脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)等[9]。酒精性肝損傷大致過程如下：在正常肝臟組織內(nèi)存在的SOD、谷胱甘肽等物質(zhì)構(gòu)成肝臟的防御系統(tǒng)，具有抗氧化能力，攝入過量乙醇后肝臟的防御系統(tǒng)受到影響并抑制谷胱甘肽的合成，SOD的抗氧化能力被降低，肝臟細(xì)胞生化平衡被打破，從而導(dǎo)致如氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化等一系列反應(yīng)，最終由于線粒體功能損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及免疫炎癥反應(yīng)而引起肝臟功能障礙[10]。已知ROS信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥氧化應(yīng)激，與代謝綜合征和糖尿病的發(fā)生有關(guān)[11]。而胰島素抵抗反過來又能加重肝細(xì)胞損傷[12]。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用減弱，游離脂肪酸在血液中的含量隨脂肪代謝能力的減弱而升高，隨著大量游離脂肪酸進(jìn)入肝臟，當(dāng)超過肝臟細(xì)胞的承受能力時(shí)，會(huì)使肝臟細(xì)胞堆積大量脂質(zhì)。同時(shí)在這一過程中會(huì)釋放大量自由基，干擾線粒體正常功能，使游離脂肪酸的代謝變得更加緩慢，脂質(zhì)蓄積增多，加重肝臟細(xì)胞的負(fù)擔(dān)[13]。

MDA是生物體內(nèi)膜質(zhì)過氧化的重要代謝產(chǎn)物，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性，其含量和脂質(zhì)過氧化程度一致。因此MDA含量，間接反映機(jī)體細(xì)胞受損程度[14]。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，能將有害的氧自由基轉(zhuǎn)化為水，使受損的細(xì)胞得到修復(fù)，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞傷害[15]。

機(jī)體攝入大量乙醇后會(huì)明顯降低肝臟細(xì)胞內(nèi)維生素A、維生素C、維生素E等抗氧化物質(zhì)所需元素，從而降低SOD的活性，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞內(nèi)大量自由基積累并超過肝臟細(xì)胞的抗氧化酶代謝能力時(shí)，肝細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損害肝臟細(xì)胞功能[16]。聯(lián)苯雙酯可保護(hù)肝臟細(xì)胞生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，改善肝細(xì)胞的抗氧化能力，是我國創(chuàng)制的護(hù)肝藥物，常用于治療肝炎和肝損傷。

熊果酸是一種三萜類化合物，最早由日本學(xué)者從越桔葉中提取得來，可用于預(yù)防心腦血管疾病，改善肝功能等[7]。

ALT、AST和GGT是臨床常用于評(píng)價(jià)肝功能受損的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)乙醇灌胃2周后，ALT、AST和GGT明顯升高，提示肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)膽管受損，說明造模成功，TG、MDA升高，提示肝損傷后脂質(zhì)積聚和代謝異常。大鼠出現(xiàn)FPG升高及FINS降低，SOD活性降低。石蠟切片可見肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤。經(jīng)熊果酸治療后，大鼠ALT、AST明顯下降，肝功能明顯改善，SOD活性升高，F(xiàn)INS水平升高，肝小葉結(jié)構(gòu)大致恢復(fù)正常，僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤，治療效果與聯(lián)苯雙酯較為一致，接近對(duì)照組水平。以上結(jié)果提示，熊果酸能提高肝細(xì)胞應(yīng)激水平，避免肝細(xì)胞進(jìn)一步受損并促進(jìn)肝功能恢復(fù)，此為今后酒精性肝損傷及其他肝病治療提供了新思路。