魯斌，俞廣進(jìn)，程敏

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院，合肥 238000；2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

我國(guó)是原發(fā)性肝癌高發(fā)的國(guó)家，每年新發(fā)病例約40萬人，約占全球新確診病例的一半左右，死亡人數(shù)超過30萬，病死率高居第二位[1]。即使患者接受了外科手術(shù)、其他抗腫瘤手段結(jié)合的綜合治療方案，仍無法有效防止復(fù)發(fā)，直徑5 cm以下的原發(fā)性肝癌患者術(shù)后3年的復(fù)發(fā)率超過50%[2]。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指特定情況下上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，一般認(rèn)為能使上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得并增強(qiáng)遷移和侵襲能力[3]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)、緊密連接蛋白(Claudin)-3是EMT相關(guān)的兩種基因，在肝癌中的研究報(bào)道較少。2013年1月～2018年3月，我們觀察了原發(fā)性肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白的表達(dá)，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2016年6月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院肝膽外科、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰一病區(qū)行肝葉切除、肝段切除術(shù)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者85例，男71例、女14例，年齡<65歲41例，65歲以上44例。均經(jīng)病理科確診為原發(fā)性肝癌，其中腫瘤直徑<5 cm 70例，≥5 cm 15例；TNM分期Ⅰ期4例，Ⅱ期51例，Ⅲ期30例；腫瘤微血管侵襲58例；肝硬化31例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理科確診為原發(fā)性肝癌；②患者病歷、隨訪資料完整，組織蠟塊標(biāo)本保存完好；③未合并其他惡性腫瘤；③未合并其他影響免疫組化結(jié)果的嚴(yán)重疾病。手術(shù)中于腫瘤病灶中心切取肝癌組織，另切取相應(yīng)距離腫瘤邊緣5 cm以上非腫瘤組織中癌旁組織作為對(duì)照。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 不同肝組織中Snail、Claudin-3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。將石蠟標(biāo)本以4 μm間隔連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化。以3%H2O2浸泡孵育15 min，PBS沖洗3×3 min。在枸櫞酸緩沖液中，于高溫高壓修復(fù)抗原約90 s，冷卻后，PBS沖洗3×3 min。滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫放置20 min。滴加一抗(鼠抗人Snail單克隆抗體、鼠抗人Claudin-3單克隆抗體，均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3×3 min。滴加二抗(羊抗鼠IgG抗體，賽默飛世爾科技公司)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3×3 min。滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，室溫反應(yīng)20 min，PBS沖洗3×3 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染。梯度乙醇脫水，常規(guī)裝片、封片。

Snail蛋白染色主要定位于細(xì)胞膜，亦可見于胞質(zhì)，Claudin-3蛋白染色定位于細(xì)胞質(zhì)。取400倍光學(xué)高倍鏡(×400)下4個(gè)視野，每個(gè)視野至少含有100個(gè)細(xì)胞。染色結(jié)果判定分為兩步：①染色強(qiáng)度計(jì)分：無染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色至黃棕色計(jì)2分，褐色計(jì)3分；②染色數(shù)目計(jì)分：染色細(xì)胞<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。各視野染色評(píng)分為強(qiáng)度計(jì)分×數(shù)目計(jì)分，最終結(jié)果取各視野評(píng)分的算術(shù)平均數(shù)，≤2分為表達(dá)陰性，>2分則為表達(dá)陽性。

1.3 隨訪 以患者術(shù)后出院為觀察起點(diǎn)，應(yīng)用電話、電子通訊等手段，對(duì)患者及家屬進(jìn)行隨訪。隨訪截止于2018年3月，隨訪時(shí)間9～66(30.76±14.77)個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為28個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)檢驗(yàn)。患者預(yù)后評(píng)估應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝組織中Snail、Claudin-3蛋白表達(dá)比較 肝癌、癌旁組織中Snail蛋白陽性表達(dá)率分別為69.41%(59/85)、36.47%(31/85)，Claudin-3蛋白陽性表達(dá)率分別為47.06%(40/85)、78.82%(40/85)，二者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為18.511、18.385，P均=0.000)。

2.2 肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白表達(dá)與患者TNM分期、微血管侵襲相關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、肝硬化無關(guān)(P均>0.05)。

2.3 肝癌組織中Snail與Claudin-3蛋白表達(dá)的關(guān)系 肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白表達(dá)均陰性3例，均陽性17例，Snail表達(dá)陽性、Claudin-3表達(dá)陰性42例，Snail表達(dá)陰性、Claudin-3表達(dá)陽性23例，Spearman等級(jí)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，肝癌組織中Snail與Claudin-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.551，P=0.000)。

2.4 肝癌組織中Snail蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 肝癌組織中Snail表達(dá)陰性與陽性者Kaplan-Meier生存曲線見圖1。肝癌組織中Snail蛋白表達(dá)陰性者術(shù)后生存率為42.31%(11/26)，術(shù)后生存時(shí)間為(40.75±3.44)個(gè)月；肝癌組織中Snail蛋白表達(dá)陽性者術(shù)后生存率為20.34%(12/59)，術(shù)后生存時(shí)間為(31.12±2.19)個(gè)月，肝癌組織中Snail蛋白表達(dá)陰性者術(shù)后生存率高于、生存時(shí)間長(zhǎng)于表達(dá)陽性者(t=15.556,P=0.000;χ2=4.413,P=0.036)。

表1 肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

圖1 肝癌組織中Snail表達(dá)陰性與陽性者Kaplan-Meier生存曲線

2.5 肝癌組織中Claudin-3蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 肝癌組織中Claudin-3表達(dá)陰性與陽性者Kaplan-Meier生存曲線見圖2。肝癌組織中Claudin-3蛋白表達(dá)陰性者術(shù)后生存率為17.78%(8/45)，術(shù)后生存時(shí)間(30.11±2.58)個(gè)月；肝癌組織中Claudin-3蛋白表達(dá)陽性者術(shù)后生存率為37.50%(15/40)，術(shù)后生存時(shí)間(40.10±3.02)個(gè)月， 肝癌組織中Claudin-3蛋白表達(dá)陰性者術(shù)后生存率低于、生存時(shí)間短于表達(dá)陽性者(t=16.446,P=0.000;χ2=4.173,P=0.041)。

3 討論

肝臟是人體功能最復(fù)雜的器官，生理病理進(jìn)程豐富，因此原發(fā)于肝臟的疾病影響因素多，機(jī)制復(fù)雜。細(xì)胞微環(huán)境指細(xì)胞及其周圍組織所組成的內(nèi)環(huán)境，有別于存在動(dòng)態(tài)平衡的正常微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境則是隨著腫瘤病情的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞不斷打破平衡并發(fā)生惡性循環(huán)[4]。其中，影響較大的即腫瘤細(xì)胞EMT進(jìn)程。EMT可表現(xiàn)為細(xì)胞間連接松動(dòng)、胞內(nèi)骨架蛋白結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞極性喪失，是細(xì)胞獲得遷移能力的重要起始生物學(xué)過程[5]。生理狀態(tài)下如胚胎發(fā)育過程中亦會(huì)有EMT發(fā)生，但EMT更常見于腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，伴隨基質(zhì)金屬蛋白酶分泌增加，微環(huán)境基質(zhì)加速降解，腫瘤細(xì)胞得以進(jìn)入脈管系統(tǒng)，從而能轉(zhuǎn)移并種植于其他臟器以形成轉(zhuǎn)移瘤[5]。因此EMT對(duì)于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲力至關(guān)重要。

圖2 肝癌組織中Claudin-3表達(dá)陰性與陽性者Kaplan-Meier生存曲線

Snail屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子，定位于人染色體20q13.13，能與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制Smad相互作用蛋白1(SIP1)，從而抑制E-cadherin、封閉蛋白(Occludin)及Claudin等蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)肝臟成纖維細(xì)胞特異蛋白(FSP1)、Rho蛋白、波形蛋白(Vimentin)等表達(dá)，影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，引起細(xì)胞骨架重組，最終誘導(dǎo)EMT發(fā)生[6]。近年研究表明，Snail蛋白在常見惡性腫瘤如卵巢癌[7]、結(jié)直腸癌[8]及罕見惡性腫瘤如胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[9]中均呈異常高表達(dá)，且均發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲力的作用。沉默Snail基因則能抑制腫瘤細(xì)胞EMT，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Snail蛋白在原發(fā)性肝癌組織中表達(dá)較非腫瘤癌旁組織中上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與臨床分期、微血管侵襲密切相關(guān)，提示Snail能促進(jìn)腫瘤的遷移與侵襲。

目前已發(fā)現(xiàn)24種Claudin蛋白家族成員，其相對(duì)分子質(zhì)量為22～27 kD，均是細(xì)胞間緊密連接的主要跨膜結(jié)構(gòu)蛋白。Claudin蛋白直徑作用于緊密連接膜相關(guān)蛋白的鳥苷酸激酶(GUK)同工酶、外周膜蛋白ZOs及富PDZ的蛋白1(MUPP-1)，且對(duì)菌環(huán)蛋白及肌動(dòng)蛋白絲結(jié)合蛋白6(AF-6)亦有間接作用，從而調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以參與細(xì)胞屏障的選擇性滲透并維持柵欄功能[11]。Che等[12]發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中Claudin-3蛋白表達(dá)下降，且Claudin-3蛋白低表達(dá)與患者較差的預(yù)后、腫瘤細(xì)胞EMT增加密切相關(guān)；Kolokytha等[13]研究發(fā)現(xiàn)，腺管狀乳腺癌組織中Claudin-3蛋白表達(dá)陽性患者組術(shù)后無復(fù)發(fā)的生存期較對(duì)照組顯著延長(zhǎng)，提示Claudin-3蛋白參與抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移與侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，Claudin-3蛋白在原發(fā)性肝癌組織中的陽性表達(dá)率較非腫瘤癌旁組織中低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與臨床病理分期、微血管侵襲密切相關(guān)，因此Claudin-3蛋白表達(dá)改變與原發(fā)性肝癌產(chǎn)生相關(guān)，且能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲。

李娟等[14]臨床研究顯示，非小細(xì)胞肺癌組織中Snail與Claudin-3蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌組織中Snail與Claudin-3蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)原發(fā)性肝癌組織中Snail、Claudin-3蛋白間的作用機(jī)制很可能與非小細(xì)胞肺癌中類似，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本研究隨訪結(jié)果顯示，原發(fā)性肝癌組織中Snail蛋白表達(dá)陽性者術(shù)后生存時(shí)間短于、生存率低于表達(dá)陰性者，Claudin-3蛋白表達(dá)陰性者術(shù)后生存時(shí)間短于、生存率低于表達(dá)陽性者，因此對(duì)于免疫組化結(jié)果如上述的患者，應(yīng)高度重視復(fù)診與隨訪，適當(dāng)加強(qiáng)治療手段的強(qiáng)度，以延長(zhǎng)患者術(shù)后生存時(shí)間，提高患者術(shù)后生存率。

綜上所述，原發(fā)性肝癌組織中Snail蛋白呈異常高表達(dá)，Claudin-3蛋白呈異常低表達(dá)，且與患者臨床表現(xiàn)、預(yù)后密切相關(guān)，原發(fā)性肝癌組織中Snail蛋白與Claudin-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；二者表達(dá)改變可能與肝癌發(fā)生與惡性進(jìn)展有關(guān)，臨床有望作為原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)記物。