張標(biāo)金，陳慶隆，戴廷燦，周瑤敏，史華新，羅林廣，魏益華，張祥喜

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西南昌330200)

硒(selenium,Se)是一種人體必需的微量營養(yǎng)元素，人體缺硒易引起生育率降低、免疫功能下降、克山病、大骨節(jié)病和增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)等多種生理健康問題[1-2]，已被世界衛(wèi)生組織和中華醫(yī)學(xué)會(huì)確定為21世紀(jì)繼碘、鋅后必補(bǔ)的第三大微量營養(yǎng)保健元素，但在全球居民中普遍攝入不足[3]。我國是缺硒比較嚴(yán)重的國家，全國土壤平均硒含量僅為0.29 mg/kg，有約70%的國土處于缺硒和低硒地區(qū)。我國成人的平均硒攝入量僅為26.63 μg/日，距離國家推薦的安全進(jìn)硒量40～240 μg/(人·日)和美國推薦的安全進(jìn)硒量50～200 μg/(人·日)都相差甚遠(yuǎn)。

水稻(OryzasativaL.)是我國半數(shù)居民的主糧，是人們膳食中硒的主要來源，因此利用天然富硒土壤生產(chǎn)出富硒稻米，從飲食方面增加人體攝硒量是一種比較理想的補(bǔ)硒途徑，而闡明水稻積累硒的分子機(jī)制是富硒水稻生產(chǎn)的理論基礎(chǔ)。土壤中的有效硒含量很低，主要取決于土壤水溶性硒含量，約占土壤全硒的1%～3%，主要包括亞硒酸鹽、可溶性有機(jī)硒和硒酸鹽[4]，而亞硒酸鹽是稻田土壤中有效硒的主要存在形式。OsNIP2;1是水稻中的硅酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子[5]，也被鑒定發(fā)現(xiàn)具有吸收轉(zhuǎn)運(yùn)亞硒酸鹽的功能[6]。

本研究利用GenBank數(shù)據(jù)庫挖掘水稻OsNIP2;1及其家族其他成員、玉米ZmNIP和擬南芥AtNIP基因家族成員的氨基酸序列信息，分析氨基酸的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)域特征，并評(píng)估3種植物NIP家族成員的親緣關(guān)系，為揭示植物亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索獲得水稻亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子OsNIP2;1的氨基酸序列，再以此為信息探針，在GenBank數(shù)據(jù)庫選擇非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫開展blastp操作，分析檢索獲得OsNIP基因家族其他成員的氨基酸序列信息。此外，用同樣的方法分別搜索獲得玉米ZmNIP和擬南芥AtNIP的基因家族成員的氨基酸序列信息，用于分析其同源進(jìn)化關(guān)系。OsNIP家族成員蛋白質(zhì)的生理生化特征(包括氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等)利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)軟件分析。用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)的親/疏水性。分別用PSORT(http://www.psort.org/)和SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析亞細(xì)胞定位和蛋白信號(hào)肽。利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)OsNIP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用ClustalX2.1對(duì)家族所有成員的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，再利用MEGA7.0的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化性質(zhì)分析

水稻亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子OsNIP2;1的氨基酸序列全長為298 aa。經(jīng)ProtParam tool對(duì)其理化性質(zhì)的分析結(jié)果表明：OsNIP2;1蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為31.978 ku，理論等電點(diǎn)pI為6.70，其分子式為C1448H2247N377O412S14。從氨基酸組成成分看，帶負(fù)電荷的天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)總數(shù)為19，占6.38%，帶正電荷的精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)總數(shù)為18，占6.04%；親水性氨基酸數(shù)為102，占34.23%，疏水性氨基酸數(shù)為157，占52.68%。(表1，圖1)。OsNIP2;1的不穩(wěn)定性指數(shù)為30.77，該參數(shù)小于40，說明該蛋白的穩(wěn)定性較好。蛋白的平均親水性系數(shù)為0.379，脂溶指數(shù)為93.39，因此該蛋白屬于疏水性蛋白。

水稻OsNIP基因家族共有10個(gè)成員，其氨基酸序列長度為273～311 aa，平均長度292.2 aa；平均理論等電點(diǎn)pI為7.57，最小值為5.62(OsNIP1;4)，最大值為9.08(OsNIP3;1)；10個(gè)OsNIP成員的蛋白平均相對(duì)分子質(zhì)量為30.640，最小值為28.402(OsNIP1;4)，最大值為31.978(OsNIP2;1)(表2)。

表1 OsNIP2;1蛋白的氨基酸組成成分

*為疏水性氨基酸，#為親水性氨基酸

* hydrophobic amino acids,# hydrophilic amino acid

圖1 OsNIP2;1蛋白的親/疏水性氨基酸分布情況Fig.1 Distribution of hydrophilic/ hydrophobic amino acids in OsNIP2;1 protein

2.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用PSORT軟件分析OsNIP2;1，發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜中；再使用SignalP 4.1預(yù)測(cè)認(rèn)為，該蛋白不包含信號(hào)肽(圖2)。TMHMM分析結(jié)果表明，該蛋白包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖3)。進(jìn)而采用SOPMA分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)分布情況，發(fā)現(xiàn)OsNIP2;1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由38.26%的α螺旋、21.48%的延伸帶、10.40%的β轉(zhuǎn)角和29.87%的隨機(jī)卷曲等構(gòu)成(圖4)。

采用相關(guān)分析軟件對(duì)OsNIP家族所有成員的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的結(jié)果表明，10個(gè)成員的蛋白都定位于細(xì)胞質(zhì)膜中；除了OsNIP1;3僅包含5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域外，其他成員都含有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；各成員蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布也相對(duì)一致，都以α螺旋和隨機(jī)卷曲為主，兩者之和約占總數(shù)70%(表3)。

表2 水稻OsNIP家族成員蛋白的基本信息

圖3 OsNIP2;1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.3 Transmembrane domain of OsNIP2;1 protein

圖4 OsNIP2;1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布Fig.4 Distribution of the secondary structure of OsNIP2;1 protein

蛋白名稱Protein name亞細(xì)胞定位Subcellular localization跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)量Transmembrane domain number二級(jí)結(jié)構(gòu)組成The secondary structure compositionα螺旋/%α helix延伸帶/%Extended strandβ轉(zhuǎn)角/%β turn隨機(jī)卷曲/%Random coilOsNIP1;1細(xì)胞質(zhì)膜636.2721.838.8033.10OsNIP1;2細(xì)胞質(zhì)膜631.0224.4211.5533.00OsNIP1;3細(xì)胞質(zhì)膜531.4725.8712.5930.07OsNIP1;4細(xì)胞質(zhì)膜633.7021.6110.9933.70OsNIP2;1細(xì)胞質(zhì)膜638.2621.4810.4029.87OsNIP2;2細(xì)胞質(zhì)膜644.3022.825.7027.18OsNIP3;1細(xì)胞質(zhì)膜625.4019.619.6545.34OsNIP3;2細(xì)胞質(zhì)膜628.2022.628.8540.33OsNIP3;3細(xì)胞質(zhì)膜636.6923.028.6331.65OsNIP4;1細(xì)胞質(zhì)膜643.0123.0810.4923.43

2.3 OsNIP家族成員的同源關(guān)系分析

分別從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得玉米ZmNIP成員和擬南芥AtNIP成員的氨基酸序列信息5和9條。采用ClustalX2.1對(duì)10個(gè)OsNIP基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，分析結(jié)果表明其一致性系數(shù)達(dá)42.92%；再對(duì)水稻、玉米和擬南芥的所有NIP成員進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示其一致性系數(shù)也高達(dá)40.56，可見NIP基因家族成員在同一植物中和不同植物間都具有很高的同源性。在進(jìn)化過程中，有部分氨基酸表現(xiàn)出高度的保守性，這些氨基酸可能是該蛋白行使生物學(xué)功能的關(guān)鍵氨基酸(圖5)。利用MEGA7.0對(duì)水稻、玉米和擬南芥的NIP成員構(gòu)建起系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)3種植物的24個(gè)成員可劃分成4個(gè)亞族(圖6)。

圖5 水稻、玉米和擬南芥NIP基因家族成員的氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Amino acid sequences alignment for members of the OsNIP gene family from rice,maize and arabidopsis

3 討論

圖6 水稻、玉米和擬南芥的OsNIP基因家族成員同源進(jìn)化樹Fig.6 Homologous evolution tree of the OsNIP gene family members from rice,maize and arabidopsis

水稻OsNIP家族包含了10個(gè)成員，目前除了已鑒定發(fā)現(xiàn)OsNIP2;1有轉(zhuǎn)運(yùn)硅酸鹽[5]、亞硒酸鹽[6]、亞砷酸鹽[8-9]的功能，OsNIP2;2[10]和OsNIP3;2[11]能夠積累亞砷酸鹽， OsNIP3;3具有轉(zhuǎn)運(yùn)水、過氧化氫、亞砷酸鹽等多種底物[12]的能力外，其他大部分成員的生物學(xué)功能尚不清楚。因此，利用生物信息學(xué)的方法，通過對(duì)亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子OsNIP2;1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行鑒定，尋找潛在的類似功能蛋白是一條重要途徑。從本研究的結(jié)果來看，水稻OsNIP家族成員的結(jié)構(gòu)高度相似，甚至與玉米、擬南芥等植物NIP家族間的進(jìn)化關(guān)系都高度保守，因此，可以推測(cè)認(rèn)為植物NIP家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物應(yīng)該具有很高的相似性。如，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNIP7;1[13]也具有轉(zhuǎn)運(yùn)亞砷酸鹽的功能，與水稻中多個(gè)同源蛋白的生物學(xué)功能一致；玉米ZmNIP2;1,ZmNIP2;4[14]和水稻OsNIP2;1[5]都能夠轉(zhuǎn)運(yùn)尿素。因此，隨著更多NIP家族成員功能的鑒定，可能將會(huì)有更多的亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子被發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步豐富水稻乃至植物中的硒轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制。

Zhao等[6]在酵母中表達(dá)OsNIP2;1時(shí)發(fā)現(xiàn)，在偏酸性條件下，OsNIP2;1可促進(jìn)亞硒酸鹽的吸收；但是在偏堿性條件下，OsNIP2;1對(duì)亞硒酸鹽的吸收能力沒有明顯變化。亞硒酸是弱酸，在不同的pH條件下，表現(xiàn)出不同的化學(xué)形態(tài)，在酸性條件下，H2SeO3是主要存在形式，因此，OsNIP2;1可能主要以H2SeO3形式轉(zhuǎn)運(yùn)亞硒酸鹽。此外，人們還發(fā)現(xiàn)植物一些磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也能夠參與亞硒酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)[15-17]。因此，可能植物中亞硒酸鹽的吸收途徑多樣，但當(dāng)前其吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、甚至外排等的分子機(jī)制都還了解甚少，這有待于進(jìn)一步開展相關(guān)基因的挖掘工作，為全面闡明植物的富硒機(jī)理，培育富硒糧食作物滿足人們的硒營養(yǎng)需求提供理論基礎(chǔ)。

OsNIP2;1是水稻中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子，主要在水稻根末梢的外皮層和內(nèi)皮層中表達(dá)[18]，在水稻硒的吸收中發(fā)揮了重要作用。我國是嚴(yán)重缺硒的國家，通過主糧的硒營養(yǎng)強(qiáng)化提高人們膳食的硒攝入量是預(yù)防硒缺乏疾病的根本出路[19]。作物的聚硒能力與作物種類、品種類型等都有關(guān)。水稻是聚硒能力較弱的作物種類之一，但品種間表現(xiàn)出較大的差異性[20]，這主要取決于品種的遺傳基因結(jié)構(gòu)。因此，OsNIP2;1的發(fā)現(xiàn)可為采用生物技術(shù)方法提高水稻聚硒能力，培育富硒稻米提供良好的理論基礎(chǔ)。此外，通過對(duì)OsNIP2;1表達(dá)模式、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等的深入研究，可為水稻硒吸收、遷移與轉(zhuǎn)化等機(jī)制的研究提供切入點(diǎn)。