韓 青，房志強(qiáng)，王振華，脫寶經(jīng)，梁 強(qiáng)，吳振彪，朱 平

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以周身關(guān)節(jié)增生和侵蝕性滑膜炎為主要病理特征的自身免疫性疾病，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，可累及全身多個(gè)器官，肺間質(zhì)病變(interstitial lung disease，ILD)是其常見的并發(fā)癥。ILD早期無明顯癥狀，故常被患者所忽略，待病變發(fā)現(xiàn)后已至晚期而難以治愈，常導(dǎo)致呼吸衰竭甚至死亡[1-2]。艾拉莫德是國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的I類新藥，是一種甲磺酰胺類非甾體抗炎藥[3]。近期的研究顯示，艾拉莫德具有抑制滑膜細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子和B 淋巴細(xì)胞的作用，并可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，阻止骨的進(jìn)一步破壞[2]。體外研究發(fā)現(xiàn)，艾拉莫德可以抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的活性，進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子的生成，如白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，推測(cè)艾拉莫德對(duì)ILD有一定的抗炎作用，但目前相關(guān)研究報(bào)道少見[4]。本研究擬通過肺纖維化模型探討艾拉莫德對(duì)ILD的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雌性C57BL/6小鼠40只，鼠齡6～8周，體重20～25 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在室溫22～24 ℃、濕度55%、日照14 h和黑夜10 h交替條件下飼養(yǎng)，每天早晚各喂料1次，清洗并更換瓶?jī)?nèi)飲用水。

1.1.2 主要藥物、試劑與儀器:艾拉莫德(T-614)(每片25 mg，南京先聲制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：090656)研成細(xì)末，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%氯化鈉溶液配置成5 mg/ml混懸液；博來霉素針劑，15 mg/支(日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將40只健康雌性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重標(biāo)記，使用BLM氣管滴注法造模并隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，每組20只，用苦味酸標(biāo)記區(qū)分每組小鼠。用3.5 mg/kg博來霉素進(jìn)行氣管滴注，使用PBS稀釋并統(tǒng)一滴注50 μl。小鼠備皮，使用微量進(jìn)樣器由軟骨環(huán)中間的位置刺入小鼠氣管，緩慢旋動(dòng)活塞推入相應(yīng)劑量的BLM，滴注完成后縫合頸部皮膚。之后將小鼠直立旋轉(zhuǎn)，使藥物均勻分布在支氣管中。造模當(dāng)天為第0天，治療組小鼠于造模后第1天開始給予艾拉莫德混懸液50 mg/(kg·d)灌胃治療，對(duì)照組小鼠以同樣方法給予PBS 0.2 ml灌胃，均持續(xù) 28 d。

1.2.2 小鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè):分別于治療后第7、14、21及28天采用頸椎脫臼法處死小鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組選取5只小鼠，取小鼠部分肺臟組織，剪切成大小為15 mm×15 mm×3 mm的組織塊，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%甲醛中固定24 h；標(biāo)本經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟和包埋后行5 μm厚切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肺臟病理學(xué)改變并進(jìn)行炎癥評(píng)分。0 分為無炎癥反應(yīng)；1 分可見少許炎細(xì)胞；2 分為輕度炎癥；3 分為中度炎癥；4 分者為重度炎癥。采用Masson染色觀察肺組織纖維化改變；采用Ashcroft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]評(píng)價(jià)模型組小鼠肺組織纖維化情況：0級(jí)為正常肺組織；1級(jí)肺泡壁或細(xì)支氣管壁見極細(xì)微的纖維性增厚；2級(jí)病理變化介于1級(jí)和3級(jí)之間；3級(jí)可見肺泡壁或細(xì)支氣管壁有中等量纖維性增厚，但無明顯肺組織結(jié)構(gòu)破壞；4級(jí)病理變化介于3級(jí)和5級(jí)之間；5級(jí)纖維化加重伴隨明顯的肺組織結(jié)構(gòu)破壞、纖維條索及小的纖維化灶形成；6級(jí)病理變化介于5級(jí)和7級(jí)之間；7級(jí)可見肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞及大面積纖維化，呈“蜂窩肺”樣改變；8級(jí)肺組織幾乎完全被纖維化組織所占據(jù)。所有評(píng)分均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行界定，以作為評(píng)分的最終結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)

治療第7天兩組小鼠肺組織片在光學(xué)顯微鏡下可見血管周圍、肺泡內(nèi)和肺泡間隔內(nèi)不同程度炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，可見少許漿細(xì)胞，部分肺泡腔被破壞或結(jié)構(gòu)消失，兩組均有大面積實(shí)變區(qū)域，對(duì)照組小鼠肺組織炎癥評(píng)分2分，治療組為1分。治療第14天可見對(duì)照組上述病變持續(xù)進(jìn)展，炎細(xì)胞聚集、浸潤加重，炎癥評(píng)分為3分；治療組小鼠肺泡及間隔病變逐漸恢復(fù)，炎細(xì)胞減少，炎癥評(píng)分為2分。治療第21天，對(duì)照組小鼠上述病變未見改善，炎細(xì)胞聚集明顯，肺組織大面積實(shí)變，炎癥評(píng)分為4分；治療組小鼠肺泡炎減輕，肺泡結(jié)構(gòu)有不同程度的恢復(fù)，炎癥評(píng)分為2分。治療第28天，對(duì)照組小鼠炎癥減輕，炎細(xì)胞聚集減少，但實(shí)變部位仍大量存在，炎癥評(píng)分為2分；治療組小鼠僅有少量肺泡炎癥，無其他病變，炎癥評(píng)分為1分(圖1)。

2.2 兩組小鼠肺纖維組織病理改變

治療第7天，兩組小鼠肺泡間隔有不同程度的膠原蛋白沉積，甚至出現(xiàn)肺實(shí)質(zhì)大片融合性病變，病變區(qū)域及輕度病變區(qū)域與正常肺組織混雜分布，呈空間異質(zhì)性，病變區(qū)域主要位于氣管和血管周圍。治療第14天，對(duì)照組小鼠肺纖維化向肺組織擴(kuò)展，肺泡結(jié)構(gòu)破壞；治療組纖維化主要存在于氣管和血管周圍，間質(zhì)部分未見改變。治療第21天，對(duì)照組小鼠肺纖維化程度達(dá)到高峰，肺組織實(shí)變區(qū)域有大量纖維化沉積；治療組小鼠肺纖維化程度逐漸減輕，肺泡結(jié)構(gòu)逐漸正常。治療第28天，對(duì)照組小鼠肺纖維化仍大量存在于氣管和血管周圍，實(shí)變組織仍未恢復(fù)；治療組小鼠肺泡及間隔恢復(fù)正常，未見纖維沉積，氣管組織彈性纖維染色呈陽性(圖2)。Ashcroft纖維化評(píng)分顯示，治療后第7天對(duì)照組與治療組小鼠肺組織Ashcroft肺纖維化評(píng)分分別為3.5±0.5和2.9±1.0，治療第14天分別為3.7±0.2和2.7±0.4，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);治療第21天對(duì)照組與治療組小鼠肺組織Ashcroft肺纖維化評(píng)分分別為4.96±0.06和0.70±0.17，治療第28天分別為4.92±0.10和0.75±0.55，對(duì)照組小鼠Ashcroft肺纖維化評(píng)分均明顯高于治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(圖3)。

圖1 治療過程中兩組小鼠肺組織炎癥評(píng)分變化(HE ×200)

Fig1 Inflammatory score of mouse lung tissue(HE ×200)

A：治療第7天對(duì)照組炎癥評(píng)分為2分； B：治療后第14天對(duì)照組炎癥評(píng)分為3分； C：治療第21天對(duì)照組炎癥評(píng)分為4分； D：治療后第28天對(duì)照組炎癥評(píng)分為2分； E：治療第7天治療組炎癥評(píng)分1分； F：治療第14天治療組炎癥評(píng)分為2分； G：治療第21天治療組炎癥評(píng)分為2分； H：治療第28天治療組炎癥評(píng)分為1分

圖2 治療過程中兩組小鼠Ashcroft肺纖維化評(píng)分變化(Masson×200)

Fig2 Pulmonary fibrosis score during treatment in mice of two groups(Masson×200)

A：治療后第7天對(duì)照組肺纖維化評(píng)分為4分； B：治療第14天對(duì)照組肺纖維化評(píng)分為5分； C：治療第21天對(duì)照組肺纖維化評(píng)分為7分； D：治療第28天對(duì)照組肺纖維化評(píng)分為7分；E：治療后第7天治療組肺纖維化評(píng)分為1分； F：治療后第14天治療組肺纖維化評(píng)分為2分，較對(duì)照組同時(shí)期肺纖維化程度減輕； G：治療后第21天治療組肺纖維化評(píng)分為2分，肺泡結(jié)構(gòu)逐漸正常； H：治療后第28天治療組肺纖維化評(píng)分為1分

圖 3 治療過程中兩組小鼠Ashcroft肺纖維化評(píng)分量化比較Fig 3 Comprison of Ashcroft pulmonary fibrosis score between two groups與各自時(shí)間點(diǎn)治療組比較，aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=5)

3 討論

艾拉莫德是一種新型小分子免疫調(diào)節(jié)劑，結(jié)構(gòu)類似尼美舒利。已有研究發(fā)現(xiàn)，艾拉莫德具有多重免疫調(diào)節(jié)功能[6-7]，能抑制單核細(xì)胞NF-κB通路及炎癥細(xì)胞因子TNF-α轉(zhuǎn)錄。Du等[8]研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德能夠下調(diào)IL-17、IL-1、IL-6、IFN-γ等炎癥因子水平，具有明顯的抗炎作用，并可以抑制關(guān)節(jié)及軟骨的降解；江維等[9]認(rèn)為艾拉莫德能通過抑制IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子、B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白IgM及IgG的產(chǎn)生，從而降低炎癥反應(yīng)程度，是一種新型的抗風(fēng)濕病藥物。艾拉莫德最初研發(fā)目的在于開發(fā)出新型非甾體抗炎藥物[10]，隨著研究的進(jìn)展，學(xué)者們逐漸發(fā)現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)作用更為突出。同時(shí)，Luo等[11]新近研究提示艾拉莫德對(duì)IL-17信號(hào)通路和小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎均有顯著抑制作用。研究提示，艾拉莫德不但對(duì)COX-1、COX-2 產(chǎn)生抑制作用，還能對(duì)免疫球蛋白、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-17 等產(chǎn)生抑制作用[12]，同時(shí)能抑制炎癥反應(yīng)，有減輕骨髓水腫、骨吸收和關(guān)節(jié)破壞的作用。

本研究結(jié)果顯示，艾拉莫德可有效減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化嚴(yán)重程度，隨時(shí)間延長效果更為明顯，實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織病理學(xué)檢查顯示，治療組小鼠在治療后肺損傷明顯改善。有研究表明艾拉莫德可通過抑制脂多糖激活大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系中的NF-κB減少肺臟的炎性改變[4]，何奕坤等[13]通過肺組織影像學(xué)及肺功能研究雖未得出艾拉莫德對(duì)于ILD改善的結(jié)論，但在治療過程中沒有出現(xiàn)感染或引起ILD進(jìn)展，說明艾拉莫德在RA和ILD治療上安全性較好。

本研究說明艾拉莫德對(duì)肺臟的損害具有明顯的保護(hù)作用，能夠有效緩解肺纖維化小鼠的病情，可用于肺纖維化的治療，本研究結(jié)果為今后ILD病變的治療提供了新的治療選擇。本研究團(tuán)隊(duì)在后續(xù)研究中將重復(fù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步通過在體研究探討艾拉莫德對(duì)B淋巴細(xì)胞的作用機(jī)制，并在臨床開展艾拉莫德治療ILD的試驗(yàn)和研究，為ILD治療探索新路徑。