章立心

研究動(dòng)機(jī)與思路

我國(guó)巢湖、太湖、滇池、漢江和錢(qián)塘江都曾連年爆發(fā)大規(guī)模的藍(lán)藻水華。藍(lán)藻水華爆發(fā)不僅破壞水體生態(tài)系統(tǒng)，危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和旅游業(yè)，還影響供水水質(zhì)，對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生極大威脅。對(duì)于藍(lán)藻水華的產(chǎn)生，研究者們認(rèn)為除了水體富營(yíng)養(yǎng)化、高溫和高光強(qiáng)等環(huán)境因素外，藻細(xì)胞上浮是藍(lán)藻水華爆發(fā)的關(guān)鍵。事實(shí)也表明，阻止藻細(xì)胞上浮能預(yù)防水華發(fā)生，而促使藻細(xì)胞沉降可以導(dǎo)致水華快速消退。因此，對(duì)藻細(xì)胞上浮機(jī)制開(kāi)展研究有助于預(yù)防和治理藍(lán)藻水華的爆發(fā)。

銅綠微囊藻（Microcystis aeru-ginosa）是中國(guó)湖泊、水庫(kù)等淡水系統(tǒng)中形成藍(lán)藻水華的主要優(yōu)勢(shì)藻類(lèi)，其分泌的微囊藻毒素對(duì)水生動(dòng)物和人類(lèi)具有極大毒性，極少量就能導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，甚至死亡。在2015年7月，我在無(wú)錫旅游期間經(jīng)歷了銅綠微囊藻水華的爆發(fā)，親眼目睹了在短短的時(shí)間內(nèi)，藻細(xì)胞大規(guī)模從水體中浮出水面，形成色如綠色油漆的藍(lán)藻水華（圖1）。為了弄清楚大量藻細(xì)胞如何能在短時(shí)間內(nèi)聚集上浮的問(wèn)題，我取了水華現(xiàn)場(chǎng)的水樣帶回研究。著手研究前，通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知，銅綠微囊藻具有氣囊，能利用氣囊垂直遷移至有利于吸收光能的位置。那么水華爆發(fā)時(shí)，藻細(xì)胞從水體中大量上浮至水面是否就是像魚(yú)兒一樣由這些類(lèi)似魚(yú)鰾的氣囊調(diào)節(jié)的？除了氣囊外，是否還有類(lèi)似魚(yú)鰭和鳥(niǎo)兒翅膀這樣的裝置幫助它們浮浮沉沉？帶著這些疑問(wèn)，我踏上了探秘之旅，在教師的幫助下，開(kāi)展了一系列實(shí)驗(yàn)。

我的思路是首先觀察氣囊和細(xì)胞上浮的關(guān)系，其次利用掃描電鏡觀察細(xì)胞表面是否具有類(lèi)似魚(yú)鰭或鳥(niǎo)類(lèi)翅膀的隱形結(jié)構(gòu)幫助它們上浮。如果有這種結(jié)構(gòu)，就用生物化學(xué)的方法探明這種結(jié)構(gòu)的物質(zhì)本質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)方法

上浮細(xì)胞和沉降細(xì)胞的氣囊觀察。通過(guò)不同離心力分別從懸浮藻液和沉降藻液中分離獲得處于不同水層的藻細(xì)胞，在顯微鏡下觀察氣囊的情況。判定氣囊和細(xì)胞浮沉的關(guān)系。

細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察。通過(guò)掃描電鏡分別觀察上浮和沉降藻細(xì)胞表面是否存在幫助細(xì)胞浮沉的結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)在廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院儀器分析測(cè)試中心教師的幫助下完成。

懸浮藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的超聲處理。為破壞藻細(xì)胞的表面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將懸浮的藻細(xì)胞液分裝在試管中，然后將試管放入超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行時(shí)間不等的超聲處理。處理后將藻細(xì)胞靜置，觀察藻細(xì)胞的浮沉狀態(tài)，并取樣用掃描電鏡觀察絲狀網(wǎng)絡(luò)的破壞情況。

細(xì)胞表面絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的成分推測(cè)。取藻細(xì)胞懸浮液高速離心去除藻細(xì)胞，得到的去藻液體再過(guò)濾一次，分別進(jìn)行37℃水浴過(guò)夜、加熱沸騰、多肽酶水解、蛋白酶S水解和蛋白酶E處理1～2小時(shí)。用處理過(guò)的去藻液體分別重新懸浮藻細(xì)胞，然后室溫靜置3小時(shí)后觀察。

絲狀網(wǎng)絡(luò)蛋白鹽析提取。絲狀網(wǎng)絡(luò)蛋白的提取采用硫酸銨沉淀法。蛋白質(zhì)沉淀用一定體積的磷酸緩沖液溶解，再高速離心1次，棄去沉淀雜質(zhì)，上清液即為蛋白質(zhì)溶液。

絲狀網(wǎng)絡(luò)蛋白的分離和鑒定。

選用蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。采用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。

絲狀網(wǎng)絡(luò)蛋白懸浮功能研究。將提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)定量后按濃度梯度分別加入到其他細(xì)胞液及淀粉等顆粒溶液中，震蕩混勻溶液，使它們重新懸浮，常溫下靜置3小時(shí)后對(duì)比觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞氣囊和細(xì)胞懸浮關(guān)系的判定

由于細(xì)胞形成氣囊后會(huì)出現(xiàn)不同的折光現(xiàn)象，所以在光學(xué)顯微鏡下能檢測(cè)細(xì)胞氣囊的有無(wú)。我們采用不同離心力分離處于不同水層的藻細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在懸浮的藻液中還是在沉降的藻液中，低離心力分離獲得的藻細(xì)胞都具有很多氣囊，而較高離心力下分離獲得的藻細(xì)胞氣囊數(shù)目都比較少。這說(shuō)明藻細(xì)胞的懸浮程度與氣囊數(shù)目并不呈正比相關(guān)性。于是我就想，氣囊可能只是增加細(xì)胞的浮力，有助于細(xì)胞上浮，但是細(xì)胞的上浮或下沉必定還存在其他影響因素。

漂浮細(xì)胞表面絲狀網(wǎng)絡(luò)的發(fā)現(xiàn)

在廈門(mén)大學(xué)教師的幫助下，我在掃描電鏡下對(duì)懸浮藻液和沉降藻液的藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，懸浮藻細(xì)胞外面布滿了納米級(jí)細(xì)絲狀網(wǎng)，而沉降細(xì)胞表面則看不到這些網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖2。因此，我懷疑藻細(xì)胞的懸浮與絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。那么，這些蜘蛛網(wǎng)樣的結(jié)構(gòu)是不是充當(dāng)了“隱形的翅膀”，讓藻細(xì)胞漂浮起來(lái)呢？如果是，那么破壞這些絲狀網(wǎng)絡(luò)，藻細(xì)胞是不是就不會(huì)漂浮而下沉了呢？

絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞上浮關(guān)系的研究

為了證實(shí)我的猜測(cè)，教師建議我從2個(gè)方面進(jìn)行檢驗(yàn)：在沉降的細(xì)胞中加入含這些絲狀網(wǎng)絡(luò)的溶液，并觀察絲狀網(wǎng)絡(luò)是否能讓沉降的細(xì)胞上??；破壞懸浮細(xì)胞的絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，觀察細(xì)胞是否下沉。

我將懸浮藻細(xì)胞溶液離心，去除藻細(xì)胞后獲得的上清液就是含有納米“蜘蛛網(wǎng)”的去藻溶液。將這種含“蜘蛛網(wǎng)”的去藻溶液按不同比例加入沉降藻細(xì)胞中，觀察含有“蜘蛛網(wǎng)”的溶液能否將沉降的藻細(xì)胞懸浮起來(lái)。結(jié)果我驚喜地發(fā)現(xiàn)，在添加含“蜘蛛網(wǎng)”的溶液后，原本沉降的藻細(xì)胞都不同程度地上浮起來(lái)。這說(shuō)明絲狀網(wǎng)絡(luò)的確能使藻細(xì)胞上浮。

我嘗試用攪拌、超聲等多種方法破壞絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，以驗(yàn)證我的第2個(gè)疑問(wèn)——破壞懸浮細(xì)胞的絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞是否下沉。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將裝有懸浮藻液的試管放在超聲清洗器中超聲50秒后，懸浮的藻細(xì)胞沉下去了。我用電鏡觀察了這支試管溶液中的絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)沉降細(xì)胞中的“蜘蛛網(wǎng)”結(jié)構(gòu)被破壞，絲狀網(wǎng)絡(luò)斷裂成短絲狀或針狀結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。這說(shuō)明，藻細(xì)胞表面的“蜘蛛網(wǎng)”確實(shí)是使細(xì)胞懸浮的主要原因，它的破壞能導(dǎo)致藻細(xì)胞下沉。

細(xì)胞表面絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的成分推測(cè)

現(xiàn)有資料顯示，藻在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)向細(xì)胞外排放許多物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖和色素等。由于藻細(xì)胞表面這種絲狀網(wǎng)絡(luò)在溶液中無(wú)色，因此它不可能是色素形成的，那么它究竟是不是像真的蜘蛛網(wǎng)一樣是由蛋白質(zhì)形成的呢？于是，我采取加熱和使用蛋白酶的方法處理含“蜘蛛網(wǎng)”的去藻溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用這2種方法處理過(guò)的溶液再去重懸藻細(xì)胞，藻細(xì)胞都有不同程度的下沉，見(jiàn)圖4。這說(shuō)明使用加熱或添加蛋白酶等破壞蛋白質(zhì)的方法都能或多或少地使含絲狀網(wǎng)絡(luò)的去藻溶液失去懸浮藻細(xì)胞的能力，由此我推測(cè)促使藻細(xì)胞懸浮的“蜘蛛網(wǎng)”很有可能是一種藻分泌的蛋白質(zhì)。

絲狀網(wǎng)絡(luò)蛋白的分離、純化和鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證“蜘蛛網(wǎng)”是由蛋白質(zhì)形成的推測(cè)，教師建議我利用蛋白質(zhì)易被鹽析出來(lái)的特性，采用硫酸銨鹽析法沉淀藻溶液中的絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。結(jié)果加入5%的硫酸銨就獲得了白色絮狀沉淀物，說(shuō)明鹽析含“蜘蛛網(wǎng)”的去藻培養(yǎng)液能得到蛋白質(zhì)，絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)確實(shí)由蛋白質(zhì)形成。

絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的懸浮功能具有廣譜性

為驗(yàn)證上面分離獲得的蛋白質(zhì)的懸浮功能和懸浮特性，用鹽析獲得的蛋白質(zhì)對(duì)不同細(xì)胞和顆粒進(jìn)行懸浮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本研究分離的懸浮蛋白質(zhì)不僅可以抑制不同細(xì)胞下沉，而且也可以抑制某些粉末和顆粒下沉，說(shuō)明絲狀網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)懸浮功能是非特異性的。

結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻細(xì)胞能分泌一種具有懸浮功能的蛋白質(zhì)，它在藍(lán)藻水華的爆發(fā)和維持過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，其良好的懸浮功能是由納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)決定的，如果用超聲波等簡(jiǎn)便易行的方法破壞這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，促使藻細(xì)胞下沉，則可使水華快速消亡，這為水華快速、高效和無(wú)害化治理提供了一種全新的思路和方法。此外，該蛋白質(zhì)還可用于水華的監(jiān)測(cè)，當(dāng)其含量達(dá)到一定濃度時(shí)，可示警水華的爆發(fā)。該蛋白質(zhì)懸浮功能的廣譜性還可應(yīng)用于新材料制備和生物制藥等領(lǐng)域，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。本研究首次發(fā)現(xiàn)了藻細(xì)胞上浮的全新機(jī)理，突破了傳統(tǒng)認(rèn)為藻細(xì)胞上浮是由氣囊決定的觀念，該理論的提出為藍(lán)藻水華的防治開(kāi)辟了一條新途徑。

該項(xiàng)目獲得第32屆全國(guó)青少年科技創(chuàng)新大賽創(chuàng)新成果競(jìng)賽項(xiàng)目中學(xué)組生物化學(xué)與分子生物學(xué)一等獎(jiǎng)。

專(zhuān)家評(píng)語(yǔ)

本項(xiàng)目從現(xiàn)實(shí)出發(fā)提出問(wèn)題，然后步步深入尋找原因及機(jī)制解決問(wèn)題，課題設(shè)計(jì)合理，解決方案可行，深入闡明了機(jī)制與原理，從不同角度解釋了藻細(xì)胞上浮的原因。本課題的關(guān)注點(diǎn)已有相關(guān)報(bào)道，創(chuàng)新性尚有欠缺。“絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)成分為蛋白質(zhì)”的結(jié)論無(wú)直接實(shí)驗(yàn)證明。建議課題的設(shè)計(jì)多考慮創(chuàng)新性。