馬會(huì)芳，魏 芳，董緒燕，陳 洪，黃鳳洪

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，農(nóng)業(yè)部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部油料作物生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)室，油料油脂加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，油料脂質(zhì)化學(xué)與營養(yǎng)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062)

脂質(zhì)是生物的重要組成成分，它不但是某些結(jié)構(gòu)的主要成分(例如細(xì)胞膜)，同時(shí)也參與信號(hào)傳導(dǎo)等重要的生理過程，脂質(zhì)的異常代謝會(huì)引發(fā)阿爾茲海默癥[1]、癌癥[2]、炎癥反應(yīng)[3]、精神分裂癥[4]、心臟病[5]等疾病。研究生物體的脂質(zhì)組成、脂質(zhì)代謝以及脂質(zhì)相互作用的科學(xué)被稱為脂質(zhì)組學(xué)。與各種組學(xué)相似，脂質(zhì)組學(xué)也需對(duì)復(fù)雜體系中的脂質(zhì)分子盡可能多的定性和定量。廣義上脂質(zhì)可定義為：存在于生物體中或食品中微溶于水，能溶于有機(jī)溶劑的一類化合物的總稱?；谥|(zhì)定義，LIPID MAPS分類系統(tǒng)將脂質(zhì)分為脂肪酸(Fatty acids)[6-7]、甘油脂(Glycerolipids)、甘油磷脂(Glycerophospholipids)[8]、鞘磷脂(Sphingolipids)、糖脂(Saccharolipids)、聚酮化合物(Polyketides)、異戊二烯醇脂(Prenol lipids)和甾醇脂(Sterol lipids) 8類，每類脂質(zhì)又能進(jìn)一步分為許多亞類或分子種[9]?；诮Y(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的不同，脂質(zhì)可被分為脂質(zhì)代謝物、非極性脂和極性脂。脂質(zhì)代謝物主要包括游離脂肪酸、長鏈?；o酶A等；非極性脂主要包括膽固醇、膽固醇酯以及甘油脂類；極性脂主要包括甘油磷脂、鞘脂和糖脂。甘油磷脂(PLs)和溶血磷脂(LPLs)均歸類為極性脂。甘油磷脂是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要組成部分，是具有關(guān)鍵生物學(xué)功能的化合物。溶血磷脂在生物信號(hào)傳導(dǎo)方面發(fā)揮著重要的功能，包括作為細(xì)胞外介質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，參與神經(jīng)系統(tǒng)和血管的發(fā)育，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)以及抑制細(xì)胞的凋亡。甘油磷脂和溶血磷脂因頭部基團(tuán)、鏈長和脂肪酸組成的不同可以分為不同的種類。因此，分析混合物中的甘油磷脂仍是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。自然界尤其是生物樣本中的甘油磷脂種類十分龐大，質(zhì)譜技術(shù)作為脂質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中最核心的研究手段，目前已能對(duì)各種脂質(zhì)進(jìn)行高分辨率、高靈敏度、高通量的分析。然而，質(zhì)譜或高分辨質(zhì)譜在甘油磷脂分析中仍存在技術(shù)瓶頸，如不同種類或相同種類不同脂肪酸組成的脂質(zhì)離子化效率差異大，會(huì)對(duì)離子化效率低的甘油磷脂分析造成干擾；商品化的甘油磷脂標(biāo)準(zhǔn)品種類有限且價(jià)格高，造成定量分析困難；甘油磷脂異構(gòu)體的鑒定仍是脂質(zhì)分析中的挑戰(zhàn)等?；谘苌馁|(zhì)譜技術(shù)可成為解決上述技術(shù)瓶頸的有效方法。

隨著電噴霧電離(ESI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)等軟電離技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜分析已成為代謝組學(xué)分析不可或缺的手段，并憑借其高靈敏度和高分離能力，逐漸成為最具潛力的分析技術(shù),可滿足更快速、靈敏和高選擇性的檢測要求[10]。相較于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)，質(zhì)譜(MS)或液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的優(yōu)勢在于可省去衍生化過程。為了增強(qiáng)分析物的揮發(fā)性和穩(wěn)定性，或影響分析物的裂解碎片，GC-MS分析中多進(jìn)行衍生化。目前衍生化技術(shù)在LC-MS分析中的應(yīng)用遠(yuǎn)不如在GC-MS法中廣泛，部分物質(zhì)并不適用于LC-MS分析，尤其是性質(zhì)不穩(wěn)定、離子化效率低、不易裂解的物質(zhì)。而衍生化技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合將增強(qiáng)基于MS或LC-MS分析平臺(tái)的分析能力，并為無法攻克的分析技術(shù)難題提供選擇方法。衍生化方法與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合的優(yōu)勢如下：①增加分析物的穩(wěn)定性；②增加分析物分子量，提高質(zhì)譜選擇性[11-13]；③利于結(jié)構(gòu)鑒定[14-15]；④通過引入易電離的基團(tuán)提高檢測靈敏度[16]；⑤同位素衍生化便于定量分析[17]；⑥增加定量線性動(dòng)態(tài)范圍等。鑒于上述優(yōu)勢，基于衍生化的質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)[18-19]、糖組學(xué)[20- 21]、藥物代謝動(dòng)力學(xué)[22]及代謝物分析[23]等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。

在Google學(xué)術(shù)數(shù)據(jù)庫中以“MS”、“Derivatization”及“Lipid”為關(guān)鍵詞搜索從2007年至今發(fā)表的論文情況，結(jié)果顯示，近10年，報(bào)道了數(shù)以萬計(jì)基于衍生化的質(zhì)譜分析方法相關(guān)論文，其中包括許多綜述[24-26]。此外，基于衍生化的質(zhì)譜分析技術(shù)在脂質(zhì)分析中的相關(guān)研究維持在5.5%以上，且在近兩年呈較快增長趨勢。因此，本文結(jié)合近10年相關(guān)研究，綜述了基于衍生化的質(zhì)譜分析技術(shù)在脂質(zhì)分析中的最新研究進(jìn)展，主要集中于甘油磷脂這一具有重要生物學(xué)功能的脂質(zhì)，并對(duì)脂質(zhì)衍生化分析方法在脂質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用和脂質(zhì)衍生化所面臨的問題及解決途徑進(jìn)行總結(jié)，以激發(fā)衍生化技術(shù)在脂質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用潛能。

1 化學(xué)衍生化技術(shù)概述

質(zhì)譜新技術(shù)的研究和發(fā)展推動(dòng)了脂質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。然而，盡管近年來脂質(zhì)組學(xué)取得相當(dāng)大的進(jìn)展，但這些分析方法仍存在許多挑戰(zhàn)。首先，大多數(shù)天然存在的脂質(zhì)存在于差異較小的質(zhì)量數(shù)范圍內(nèi)，且常有同位素的干擾(相同質(zhì)量數(shù)、結(jié)構(gòu)不同的脂質(zhì))。其次，盡管色譜分離可將脂質(zhì)種類分開，但許多重要的低豐度脂質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定常被一些高濃度或易離子化的脂質(zhì)部分或全部抑制。最后，內(nèi)源性和外源性化學(xué)信號(hào)會(huì)干擾阻礙生物樣本中復(fù)雜脂質(zhì)的定性分析。為克服這些缺點(diǎn)，研究人員對(duì)儀器的設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，以提高色譜分離度和質(zhì)譜的分辨率。但濃縮小體積的生物樣本十分困難，所以通過降低檢出限(LOD)和提高靈敏度可以降低檢測分析所需生物樣本的體積。

化學(xué)衍生化是提高質(zhì)譜檢測靈敏度的有效策略，大量的衍生化試劑已被合成且相應(yīng)的衍生化方法已被建立[27]。在進(jìn)行MS分析前，應(yīng)針對(duì)目標(biāo)化合物的特異性基團(tuán)進(jìn)行衍生化反應(yīng)以增強(qiáng)離子化效率。衍生化反應(yīng)后，化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化，從而影響其穩(wěn)定性、極性、溶解度、保留時(shí)間和電離效率[28]。大多數(shù)基于質(zhì)譜技術(shù)的衍生化技術(shù)旨在提高檢測的靈敏度、選擇性和特異性。

1.1 衍生化反應(yīng)

衍生化反應(yīng)是基于目標(biāo)化合物中的反應(yīng)基團(tuán)和衍生化試劑發(fā)生的一種特定的化學(xué)反應(yīng)。根據(jù)目標(biāo)化合物基團(tuán)的結(jié)構(gòu)和研究目的確定衍生化試劑以及衍生化反應(yīng)的類型。另外，衍生化試劑中的修飾基團(tuán)可以增強(qiáng)目標(biāo)化合物的特異性。衍生化試劑可與含有各種基團(tuán)的目標(biāo)化合物反應(yīng)，包括羰基[29]、羥基[30]、羧基[31]和氨基[32]。衍生化反應(yīng)具有以下特征：①衍生化反應(yīng)較穩(wěn)定且完全。②產(chǎn)生的副反應(yīng)和副產(chǎn)物較少，且副產(chǎn)物易去除。③反應(yīng)針對(duì)特定的基團(tuán)進(jìn)行，可減少復(fù)雜基質(zhì)的干擾。④衍生化產(chǎn)物較穩(wěn)定，在較長的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生降解，便于檢測分析。因此，適當(dāng)?shù)难苌瘜?duì)實(shí)現(xiàn)基于衍生化結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)的快速、特異性脂質(zhì)分析十分重要。

1.2 衍生化反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)

衍生化反應(yīng)主要用于提高分析物的檢測靈敏度和選擇性，根據(jù)其在質(zhì)譜分析過程中的作用，可將衍生化反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)分為以下方面：

(1)引入易電離的基團(tuán)。在利用ESI和APCI對(duì)中性化合物進(jìn)行分析時(shí)電離效率較低，從而阻礙了常規(guī)質(zhì)譜在這類化合物中的分析應(yīng)用[33-34]。在正離子ESI模式下，引入堿性化學(xué)基團(tuán)，包括帶永久電荷(季銨和吡啶)和易于離子化的基團(tuán)(伯胺、仲胺和叔胺等)，可顯著增強(qiáng)質(zhì)譜的響應(yīng)。在正離子APCI模式下，目標(biāo)化合物中引入含氧和氮原子的基團(tuán)可有效提高靈敏度[35-38]。在負(fù)離子ESI模式下，引入易去質(zhì)子化的酸性基團(tuán)(如磺酸基和羧基)可提高靈敏度。而在負(fù)離子APCI模式下，目標(biāo)化合物中引入易與電子親和的衍生化試劑[39-41]可顯著提高離子化效率。

(2)確定特定的化學(xué)基團(tuán)?；瘜W(xué)衍生化與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合有利于分析物的結(jié)構(gòu)鑒定和解析。通過分析化學(xué)衍生化前后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)很容易獲得大量的結(jié)構(gòu)信息[42]。此外，通過衍生化引入的基團(tuán)標(biāo)記化合物，可以提高M(jìn)S/MS法的選擇性，且適于應(yīng)用中性丟失和前體離子掃描模式篩選特定的化合物。在化學(xué)衍生化過程中，代謝物已按照不同基團(tuán)進(jìn)行分類，分別對(duì)其進(jìn)行分析，通過綜合多次分析的結(jié)果，可獲知代謝物的結(jié)構(gòu)及含量。該方案適用的脂質(zhì)及其代謝物種類有氨基化合物、羥基化合物、巰基化合物、羰基化合物和羧基化合物。相關(guān)研究已獲得一定的進(jìn)展，如氨基化合物12C/13C丹磺酰氯標(biāo)記法[43-45]、H/D雙甲基化標(biāo)記法[46]及H/D 雙乙基化標(biāo)記法[47]。本實(shí)驗(yàn)室[48]使用H/D丙酮對(duì)羧酸化合物(磷脂酰乙醇胺)進(jìn)行同位素標(biāo)記和相對(duì)定量分析。Xu等[49]則利用H/D二甲胺基苯甲酸與羥基化合物的酯化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了體液中激素的同位素標(biāo)記和相對(duì)定量分析。

(3)提高定量分析的準(zhǔn)確性。質(zhì)譜是一種高選擇性、高靈敏度的檢測器，但具有穩(wěn)定性較差、信號(hào)受基質(zhì)影響大等缺點(diǎn)，因此外標(biāo)法并不適用于質(zhì)譜定量分析。通過使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)目標(biāo)物的絕對(duì)定量。然而，對(duì)于部分分析物，其內(nèi)標(biāo)獲得困難，不利于使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。例如，通過合成大量的同位素標(biāo)記的多肽作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)多肽實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的絕對(duì)定量分析是十分困難的。為解決以上問題，開發(fā)了穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，即實(shí)驗(yàn)組在生長和發(fā)育過程中所攝入的營養(yǎng)元素被輕穩(wěn)定同位素所標(biāo)記，而對(duì)照組攝入的這種營養(yǎng)元素則為天然的同位素形式。一段時(shí)間后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別被不同的同位素穩(wěn)定標(biāo)記，經(jīng)過相同的樣品前處理步驟處理，等量混合后進(jìn)行分離和質(zhì)譜鑒定。由于化學(xué)結(jié)構(gòu)及保留時(shí)間相同，重同位素標(biāo)記后的化合物與天然同位素形式的化合物具有相同的基質(zhì)效應(yīng)，一級(jí)質(zhì)譜圖中兩個(gè)同位素的相對(duì)峰高反映了兩組樣品中該分析物的相對(duì)含量。對(duì)樣品分別進(jìn)行輕、重穩(wěn)定同位素標(biāo)記，不同穩(wěn)定同位素標(biāo)記的樣品等量混合后，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，通過比較不同標(biāo)記的分析物的色譜峰面積以及質(zhì)譜的離子化碎片，對(duì)其進(jìn)行相對(duì)定量分析，以找出具有顯著性差異的分析物。

2 甘油磷脂的化學(xué)衍生化分析

甘油磷脂是所有活體細(xì)胞膜的主要成分，包含1個(gè)極性的磷酸頭部基團(tuán)和1個(gè)或2個(gè)非極性脂肪?；膊炕鶊F(tuán)。由于極性頭部基團(tuán)的差異，甘油磷脂呈現(xiàn)不同的種類：磷脂酸(Phosphatidicacid,PA)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanilamine,PE)、磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinoitide,PI)和磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol,PG)等(圖1)。各類甘油磷脂的差別主要在于頭部基團(tuán)的極性大小、形狀和電荷的差異；每一類甘油磷脂均含2個(gè)脂肪酸?；?sn-1和sn-2)和特異性的頭部基團(tuán)(sn-3)，且因脂肪酸酰基鏈長度、不飽和度及頭部基團(tuán)的不同而存在若干種結(jié)構(gòu)的甘油磷脂[50-52]。根據(jù)sn-1位置上脂肪鏈的不同，又可將各類甘油磷脂進(jìn)一步分成磷脂酰酯、磷脂縮醛醚酯和磷脂烷基醚酯3個(gè)亞類(圖2)。甘油磷脂中含有氨基、羧基、羥基、磷酸鹽等活性基團(tuán)，對(duì)甘油磷脂的衍生化通?；谏鲜龌鶊F(tuán)進(jìn)行。

圖1 甘油磷脂的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of glycerophospholipid

圖2 磷脂酰酯(A)、磷脂縮醛醚酯(B)和磷脂烷基醚酯(C)的結(jié)構(gòu)簡式Fig.2 Structures of diacyl PL(A),alkenyl-acyl PL(B) and alkyl-acyl PL(C)

2.1 甘油磷脂的甲基化化學(xué)衍生分析

目前衍生化方法主要用于蛋白質(zhì)和代謝物的分析，在甘油磷脂中的應(yīng)用相對(duì)較少且主要針對(duì)某類或含有特定共同基團(tuán)的某幾類甘油磷脂進(jìn)行，對(duì)所有甘油磷脂共同衍生的報(bào)道相對(duì)較少。甲基化是脂質(zhì)分析中常用的衍生化技術(shù)，常見于脂肪酸分析的甲酯化，該方法在質(zhì)譜分析中的作用日益突出。甲基化不僅能提高M(jìn)S檢測靈敏度，還可用于甘油磷脂的MS鑒定和擴(kuò)充MS在脂質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用廣度。甘油磷脂的質(zhì)譜分析中，電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)是鑒定總脂質(zhì)提取物中PC的有力工具。PC含有帶正電的季胺膽堿頭部基團(tuán)，易在正離子模式下以fmol/L靈敏度被檢出。碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)子化的PC可產(chǎn)生大量碎片離子，并具有磷酸膽堿m/z184.07部分，該片段常用于通過三重四極桿或混合四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀前體離子掃描(PIS)定量分析PC分子種。而含氨基的甘油磷脂常含有伯胺、仲胺和叔胺的甘油磷脂頭部基團(tuán)，此化學(xué)性質(zhì)使其易受內(nèi)源性PC、三酰甘油和基質(zhì)成分潛在離子抑制效應(yīng)影響。

PC和鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)是兩類含有季銨鹽基團(tuán)的甘油磷脂，一般難以實(shí)現(xiàn)衍生化，但可通過對(duì)磷酸根上的氧負(fù)離子或羥基衍生，中和其負(fù)電荷，固定季銨鹽基團(tuán)上的正電荷。所以，對(duì)于所有甘油磷脂的衍生一般是基于其共同存在的磷酸基團(tuán)進(jìn)行。Wasslen等[53]使用重氮甲烷與氨基和磷酸基團(tuán)作用，甲基化固定氨基上的正電荷，中和磷酸根上的負(fù)電荷，使甘油磷脂帶上了恒定的正電荷。通過電離特性的改善和鞏固離子解離形成1個(gè)或2個(gè)很強(qiáng)的特征極性頭部碎片，使衍生后脂質(zhì)的MS檢測靈敏度顯著提高，其中PS和PE的檢測靈敏度分別提高了32.4倍和2.21倍。

Canez等[54]同樣采用12C/13C重氮甲烷標(biāo)記從HeLa細(xì)胞中提取的PE、PC、PS，并通過前體離子掃描模式對(duì)其進(jìn)行檢測。由于其在前體離子掃描時(shí)均有不同的特異性碎片，通過衍生化標(biāo)記可區(qū)分PE和PC的同分異構(gòu)體，其中PE的前體離子碎片為m/z202.1，PS的前體離子碎片為m/z148.1和261.1，PC和鞘磷脂(SM)的前體離子碎片均為m/z199.1，雖然PC和SM前體離子掃描的結(jié)構(gòu)相同，但其質(zhì)荷比分別為奇數(shù)和偶數(shù)。經(jīng)重氮甲烷衍生化反應(yīng)后PE、PC和SM的靈敏度分別提高了10.72、2.36和1.05倍。但重氮甲烷衍生化試劑對(duì)呼吸道有強(qiáng)烈的刺激作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，且屬于易爆、可燃和高毒的危險(xiǎn)品。因此，需找到一種易于合成、使用，質(zhì)譜分析時(shí)穩(wěn)定性較好的同位素標(biāo)記衍生化試劑。Lee 等[55]采用超臨界流體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)與三甲基硅烷化重氮甲烷(TMSD)發(fā)生甲基化反應(yīng)的甘油磷脂進(jìn)行分析(圖3)，在所有甘油磷脂的磷酸根上引入1個(gè)甲基，使得甘油磷脂的質(zhì)譜響應(yīng)及色譜峰形均得到極大改善。其中PS、PA、溶血磷脂酰絲氨酸(LPS)、溶血磷脂酰甘油(LPI)、 溶血磷脂酸(LPA)、神經(jīng)酰胺-1-磷酸(Ceramide-1-phosphate,Cer1P)、鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate,So1P)和神經(jīng)鞘氨醇-1-磷酸(Sphinganine-1-phosphate,Sa1P)的檢出限分別提高了7.5、26.7、600、116.7、500、75、3 000和4 500倍。該方法在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)19類(包含甘油磷脂、溶血磷脂和鞘脂)極性脂質(zhì)的高通量、高分辨率分析。Cai等[56]報(bào)道了用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的三甲基硅烷化重氮甲烷與甘油磷脂發(fā)生衍生化反應(yīng)的方法，可以快速對(duì)生物樣本中的6類甘油磷脂進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析。將氫/氘(H/D)標(biāo)記的甘油磷脂以已知比例混合，對(duì)其進(jìn)行相對(duì)定量分析。該方法具有足夠的靈敏度、準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性，且平均變異系數(shù)為9.1%。

圖3 三甲基硅烷化重氮甲烷(TMSD)標(biāo)記甘油磷脂[55]Fig.3 TMSD derivatization of glycerophospholipid[55]

磷脂酰肌醇是甘油磷脂中較為重要的一部分，包含磷脂酰肌醇磷酸(PtdInsP)、磷脂酰肌醇二磷酸(PtdInsP2)、磷脂酰肌醇三磷酸(PtdInsP3)、磷脂酰肌醇四磷酸(PtdInsP4)和磷脂酰肌醇五磷酸(PtdInsP5)。它們在組織中具有重要作用，參與細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)的運(yùn)輸?shù)戎匾顒?dòng),由于其極性較強(qiáng)，含量和離子化效率較低，特別是磷酯酰肌醇-3,4,5-磷酸(PtdIns(3,4,5)P3)，故對(duì)細(xì)胞中此類低濃度脂質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量極其困難。已報(bào)道的分析方法對(duì)PtdIns(3,4,5)P3的檢測局限性主要在于：靈敏度低、放射性元素標(biāo)記、通量較低和無法確定脂肪酸?；M成等。2011年Clark等[57]以TMSD與PtdIns(3,4,5)P3的磷酸根進(jìn)行甲基化反應(yīng)，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用方法，對(duì)小鼠和人細(xì)胞或組織中的PtdIns(3,4,5)P3進(jìn)行定性和定量分析，克服了之前分析方法的缺點(diǎn)。2014年Kielkowska等[58]應(yīng)用TMSD對(duì)細(xì)胞和組織中的PtdIns、PtdInsP、PtdInsP2和PtdInsP34類脂類進(jìn)行衍生化處理[59-60]，對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析，為進(jìn)一步了解該類脂質(zhì)在正?；虿±頎顟B(tài)的生物體中所起的作用提供了一種靈敏和準(zhǔn)確的方法。2016年Cai等[61]建立了一種可以快速、靈敏分析磷脂酰肌醇三磷酸、磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰肌醇磷酸的新方法，使用“甘油二酯離子碎片+多重前體離子掃描”技術(shù)(DAG+MPIS)對(duì)甲基化的磷脂酰肌醇進(jìn)行定性分析。利用這種簡單高效的方法對(duì)牛腦提取物或前列腺癌細(xì)胞系中32個(gè)PtdIns、28個(gè)PtdInsP、30個(gè)PtdInsP2和3個(gè)PtdInsP3分子種類進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)了許多此前未檢測到的脂肪酸組成的磷脂酰肌醇。該分析方法利用氘代標(biāo)記的重氮甲烷(CD2N2)對(duì)內(nèi)源性磷酸肌醇進(jìn)行同位素標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了磷脂酰肌醇的準(zhǔn)確定量分析。結(jié)果表明，同位素標(biāo)記可以實(shí)現(xiàn)PtdInsP3、PtdInsP2和PtdInsP的準(zhǔn)確定量，具有良好的線性和重現(xiàn)性，平均變異系數(shù)為18.9%。更為重要的是，該方法無需多種磷脂酰肌醇內(nèi)標(biāo)。DAG+MPIS和基于同位素標(biāo)記的磷脂酰肌醇質(zhì)譜分析相對(duì)于現(xiàn)有的分析方法具有一定優(yōu)勢，為磷酸肌醇代謝途徑研究提供了強(qiáng)有力的工具。

本實(shí)驗(yàn)室[62]以TMSD作為衍生化試劑，對(duì)甘油磷脂進(jìn)行甲基化，并結(jié)合shotgun-ESI-MS技術(shù)建立了基于甲基化和穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)的甘油磷脂的高效定性和定量分析方法。通過TMSD衍生結(jié)合穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)，一方面建立了甘油磷脂的相對(duì)定量分析方法，另一方面通過在各類甘油磷脂中選擇多個(gè)“輕”同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)制作校準(zhǔn)曲線，建立了6類甘油磷脂的準(zhǔn)確定量分析方法。應(yīng)用該方法結(jié)合混合模式固相萃取技術(shù)，分析了高血脂病人血漿中甘油磷脂組分含量的變化，同時(shí)驗(yàn)證了所建立的相對(duì)定量和絕對(duì)定量分析方法在實(shí)際生物樣本中應(yīng)用的可行性。這種絕對(duì)定量方法解決了因碳鏈長度不同與不飽和度導(dǎo)致的甘油磷脂質(zhì)譜響應(yīng)差異及定量不準(zhǔn)確的問題，能獲得PLs較為準(zhǔn)確的定量結(jié)果，且極大增加了甘油磷脂定量過程中內(nèi)標(biāo)物選擇的廣度。Han等[63]以TMSD為衍生化試劑，對(duì)多不飽和磷脂酰肌醇(PPI)進(jìn)行甲基化反應(yīng)，用于全面分析PPI磷酸的位置和脂肪酸酰基鏈的結(jié)構(gòu)，并應(yīng)用該方法定量分析糖尿病小鼠中PPI的組成及含量，首次揭示了db/db小鼠腦皮質(zhì)中PPI水平有顯著降低的趨勢。Ejsing等[64]基于PE等含氨基甘油磷脂與含重氫的碘甲烷(CD3I)發(fā)生甲基化反應(yīng)可生成PC類似物，并分別產(chǎn)生一定分子量的特異性分子偏移的原理，建立了一種“Mass tag”方法，同時(shí)鑒定和定量分析了脂質(zhì)提取物中PE、單甲基化磷脂酰乙醇胺(MMPE)、雙甲基化磷脂酰乙醇胺(DMPE)、PE和PC的種類。

2.2 氨基甘油磷脂的化學(xué)衍生化分析

氨基甘油磷脂是頭部基團(tuán)帶氨基的甘油磷脂，主要包括磷PE和PS兩類甘油磷脂。2005年Murphy等[65]采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的N-甲基哌嗪乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(DMABA)標(biāo)記氨基甘油磷脂時(shí)，發(fā)現(xiàn)N-甲基哌嗪-酰胺標(biāo)記的氨基甘油磷脂在質(zhì)譜檢測中產(chǎn)生m/z114～117的碎片離子，不易于定性分析，而改用MS3方法時(shí)可成功用于對(duì)人類多形核白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中多不飽和氨基甘油磷脂的定量分析。2009年Murphy等[66]應(yīng)用含有4種穩(wěn)定同位素標(biāo)記的4-(二甲基氨基)苯甲酸(DMABA)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯試劑與PE的伯胺基團(tuán)發(fā)生衍生化反應(yīng)，在正離子模式下應(yīng)用前體離子掃描m/z191.1、195.1、197.1和201.1，對(duì)(D0、D4、D6和D10)-DMABA衍生化標(biāo)記的PE進(jìn)行特異性分析。并利用2,2′-偶氮二 -(2-脒基丙烷)鹽酸鹽(AAPH)對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分別處理0、30、60、300 min，將經(jīng)不同處理時(shí)間的細(xì)胞分別用(D0、D4、D6和D10)-DMABA衍生化標(biāo)記后進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的延長，內(nèi)源性PE和氧化PE的含量均有所升高。

2012年Fhaner等[67]利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的S，S′-二甲基硫代丁酰羥基琥珀酰亞胺酯(DMBNHS)對(duì)含有氨基的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸進(jìn)行標(biāo)記，并成功對(duì)直腸癌細(xì)胞SW480中249種脂質(zhì)進(jìn)行了相對(duì)定量分析。DMBNHS衍生化反應(yīng)前后分析物的質(zhì)量位移可減少脂質(zhì)間的干擾，且提高分析靈敏度，為應(yīng)用直接進(jìn)樣法鑒定同類脂質(zhì)或脂質(zhì)同分異構(gòu)體分子提供了一種新思路。2015年Nie等[68]同樣利用DMBNHS和碘/甲醇對(duì)氨基甘油磷脂進(jìn)行衍生化標(biāo)記，與未衍生化標(biāo)記的氨基甘油磷脂相比，衍生化標(biāo)記的氨基磷脂靈敏度顯著提高，且經(jīng)過對(duì)MS3裂解碎片的分析可實(shí)現(xiàn)對(duì)同分異構(gòu)體(烷基醚酯和縮醛醚酯)的鑒定。

Han等[69]通過用芴基甲氧羰基(Fmoc)氯化物對(duì)脂質(zhì)提取物進(jìn)行簡單的前處理，將PE和溶血PE物質(zhì)衍生為相應(yīng)的氨基甲酸酯。適當(dāng)稀釋后，將反應(yīng)溶液直接注入電噴霧電離質(zhì)譜儀的離子源。由于在碰撞誘導(dǎo)解離時(shí)，易產(chǎn)生Fmoc母核中性丟失的特異性碎片，從而顯著提高了分析靈敏度，且更有利于對(duì)低豐度脂質(zhì)分子種類進(jìn)行定性和定量分析。該方法比直接進(jìn)樣質(zhì)譜法的靈敏度提高了100倍以上，且線性動(dòng)態(tài)范圍大于15 000倍，方法簡單、高效，為實(shí)現(xiàn)多種脂質(zhì)化合物(特別是分子量相近或同分異構(gòu)體脂質(zhì))的同時(shí)定性和定量分析提供了一種新策略。本實(shí)驗(yàn)室[48]采用丙酮穩(wěn)定同位素衍生化結(jié)合雙中性丟失掃描直接進(jìn)樣質(zhì)譜法(ASID-DNLS)對(duì)PE進(jìn)行定性和定量分析，方法簡單、高效、準(zhǔn)確、價(jià)廉，且避免了過量衍生試劑影響離子化效率的問題以及同位素峰重疊現(xiàn)象，特別適合于相對(duì)定量分析。采用該方法共鑒定了大鼠肝臟樣本中的45種PE，與對(duì)照組相比，高脂飲食組大鼠肝臟的總PE水平呈下降趨勢。

2.3 基于化學(xué)衍生化方法分析甘油磷脂同分異構(gòu)體

2.3.1甘油磷脂脂肪酸鏈異構(gòu)體的分析18-crown-6 ether(18C6)衍生PE也能使PE產(chǎn)生質(zhì)量偏移，從而將分子結(jié)構(gòu)相似且某些情況下分子量相同的PC和PE區(qū)分。 Pham等[70]用18C6與PE發(fā)生非共價(jià)絡(luò)合，產(chǎn)生264 Da的分子偏移而將PE與其同分異構(gòu)體形式的PC分離。同時(shí)，由于18C6的加入能顯著影響電噴霧離子化的離子豐度，使得衍生化后PE的分析靈敏度提高了1個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，非共價(jià)絡(luò)合衍生還能進(jìn)行甘油磷脂脂肪?；悩?gòu)體鑒定。當(dāng)前脂質(zhì)組學(xué)方法主要依賴于傳統(tǒng)的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行脂質(zhì)鑒定，該法可應(yīng)用于鑒定脂質(zhì)種類，確定?；溙荚訑?shù)及不飽和度，但由于傳統(tǒng)的低能量碰撞誘導(dǎo)解離不能從脂肪?；逆滈g斷裂產(chǎn)生產(chǎn)物離子，故在鑒定由雙鍵位置、鏈分支和環(huán)狀結(jié)構(gòu)引起的同分異構(gòu)體方面存在局限性。為此，Pham等[71]首次將自由基定向解離(RDD)應(yīng)用于脂質(zhì)分析，在該方法中，包含1個(gè)光電籠形自由基引發(fā)劑和脂質(zhì)內(nèi)收基團(tuán)的雙官能團(tuán)分子(如：4-碘苯胺、4-碘苯甲酸)被用于與脂質(zhì)在電噴霧離子化過程中形成非共價(jià)復(fù)合物(即加合離子)。激光照射(UV 波長266 nm)這些復(fù)合物裂解C—I鍵可釋放一種高活性的苯自由基，后續(xù)活化新生自由基離子將導(dǎo)致自由基定向解離，從而使得?；糠之a(chǎn)生顯著的鏈內(nèi)碎片。利用脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證了RDD分析可應(yīng)用于脂質(zhì)同分異構(gòu)體的鑒定，同時(shí)還揭示了橄欖油和人極低密度脂蛋白的結(jié)構(gòu)多樣性。18C6與PE非共價(jià)絡(luò)合也能應(yīng)用于RDD對(duì)PE脂肪?；湲悩?gòu)體進(jìn)行鑒定。此法可以產(chǎn)生雙鍵位置和脂肪酸鏈相關(guān)的診斷碎片，為甘油磷脂、鞘磷脂和甘油三酯同分異構(gòu)體鑒定提供了一種方法。

圖4 丙酮與不飽和PC18∶0/18∶1(9)的光催化衍生化反應(yīng)[73]Fig.4 PB reactions and CID fragmentation pathways of PC isomers:PC 18∶0/18∶1(9)[73]

3 展 望

近年來,脂質(zhì)衍生化相關(guān)研究逐漸增多,基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用也日益廣泛，同時(shí)，各種相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析軟件的編寫,均為脂質(zhì)衍生化的研究提供了理論基礎(chǔ)和條件。盡管目前已有很多商業(yè)化的穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑,但開發(fā)新的試劑仍將是今后的工作重點(diǎn)。為獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，體現(xiàn)衍生化的優(yōu)勢，開發(fā)的衍生化試劑需考慮以下因素：①衍生化試劑盡可能同時(shí)標(biāo)記樣品中所有的甘油磷脂；②衍生化標(biāo)記后的甘油磷脂質(zhì)量差易于檢測分析；③衍生化試劑廉價(jià)易得，衍生化反應(yīng)的步驟簡單、條件溫和，過量的衍生化試劑應(yīng)去除，以降低其對(duì)衍生化產(chǎn)物的干擾；④衍生化產(chǎn)物在多維色譜分離和質(zhì)譜中穩(wěn)定，較少產(chǎn)生干擾譜圖解析的碎片離子；⑤衍生化標(biāo)記對(duì)甘油磷脂離子化效率和出峰時(shí)間的影響；⑥衍生化產(chǎn)物可以產(chǎn)生豐富的二級(jí)碎片離子，利于甘油磷脂位置異構(gòu)體(雙鍵位置異構(gòu)、順反異構(gòu)等)的結(jié)構(gòu)鑒定；⑦衍生化方法能否允許兩個(gè)或兩個(gè)以上的樣品同時(shí)分析；⑧衍生化方法盡可能適用于所有生物樣本。開發(fā)新型的穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑的同時(shí),也應(yīng)開展新型質(zhì)譜的研發(fā)。更快的掃描速度，更高的靈敏度、準(zhǔn)確度及分辨率將是未來質(zhì)譜的發(fā)展方向。此外，各種與數(shù)據(jù)分析相關(guān)軟件的編寫也至關(guān)重要。這些問題均為基于衍生化的脂質(zhì)組學(xué)分析方法研究的重點(diǎn)和難點(diǎn),也是未來研究的發(fā)展趨勢。