黃 曉，田琴琴，范榮榮，李 輝，黃 保，鄒 星，朱 輝*，黃正旭,

(1.昆山禾信質(zhì)譜技術(shù)有限公司，江蘇 昆山 215300；2.廣州禾信儀器股份有限公司，廣東 廣州 510632；3.暨南大學(xué) 質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632)

近十年來，隨著電噴霧電離(Electrospray ionization，ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix assisted laser desorption ionization，MALDI)等軟電離技術(shù)的日趨成熟[1-2]，生物質(zhì)譜技術(shù)得到了長足發(fā)展，亦使儀器裝置的競爭達到了白熱化的程度。飛行時間質(zhì)譜儀(Time-of-flight mass spectrometer，TOF MS) 具有靈敏度好、質(zhì)量分辨率高、分析速度快、質(zhì)量檢測上限只受離子檢測器限制等優(yōu)點[3-5]，結(jié)合ESI源，還可得到較寬的質(zhì)量范圍，非常適合于有機聚合物、大分子及生物樣品的檢測[6-8]。但是，脈沖式工作方式的TOF MS結(jié)合產(chǎn)生連續(xù)離子流的ESI源，存在儀器占空比低及離子利用率不高的問題[9]。為解決此問題，Chernushevich等[10-11]先后開發(fā)了一種將離子囚禁后再定時釋放的垂直引入式TOF分析器，其占空比接近100%，但質(zhì)量范圍很窄。為此，Okumura等[12]將三維(3-Dimensional，3-D)離子阱和TOF雜化聯(lián)用以提高質(zhì)量范圍，但3-D離子阱存在空間電荷效應(yīng)，離子容量較小，靈敏度低。由于LIT(Linear ion trap，LIT)在離子捕獲、存儲效率和質(zhì)量分辨率等方面比3-D離子阱更有優(yōu)勢，Douglas[13]、Hashimoto[14]等先后開發(fā)出LIT與TOF的聯(lián)用技術(shù)，在m/z174～1 922質(zhì)量范圍內(nèi)儀器的占空比提高到60%以上，極大提高了TOF的靈敏度。

本研究將ESI源、LIT和TOF結(jié)合，研制了一款具有線性離子阱功能的飛行時間質(zhì)譜儀—LIT-TOF MS，開發(fā)出LIT與TOF的聯(lián)動脈沖技術(shù)，進一步提升了儀器的占空比，從而獲得更好的靈敏度。本文詳細介紹了該自制LIT-TOF MS的結(jié)構(gòu)，并通過對儀器的質(zhì)量分辨率、質(zhì)量范圍、靈敏度和多級質(zhì)譜能力的考察，展示了該儀器在藥品、環(huán)境、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

1 儀器研制

自制的LIT-TOF MS儀器結(jié)構(gòu)如圖1所示，按功能分為質(zhì)譜接口、離子導(dǎo)引射頻四極桿、線性離子阱、離子光學(xué)系統(tǒng)及飛行時間質(zhì)量分析器5個部分。分析物離子由大氣壓下電離源(如ESI等)產(chǎn)生，在電場牽引下，被送入質(zhì)譜儀器的接口，經(jīng)過加熱不銹鋼毛細管(Capillary)、管型透鏡(Tube lens)、分離錐(Skimmer)，進行差分真空后進入射頻四極桿(Radio frequency quadrupole，RFQ)中，再聚焦在中心軸附近進入LIT中，離子在LIT內(nèi)按需要經(jīng)母離子篩選、碰撞誘導(dǎo)解離(Collision induced dissociation，CID)等后引入直流四極桿(DC Quadrupole，DCQ)及離子光學(xué)透鏡(Lens)，聚焦后進入TOF分析器進行檢測。

圖1 儀器結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the instrument

LIT-TOF MS可在3種模式間自由切換：(1)TOF模式：ESI源產(chǎn)生的連續(xù)離子流在LIT中只進行碰撞冷卻，被TOF直接檢測；(2)Trap模式：結(jié)合LIT的囚禁功能，使離子源產(chǎn)生的連續(xù)離子流變?yōu)槊}沖式離子流，提高儀器占空比；(3)LIT-TOF聯(lián)用模式：通過離子阱上的寬頻頻率掃描對目標離子進行隔離，然后通過輔助射頻信號進行裂解，再進入TOF MS檢測，記錄隔離母離子的碎片譜圖。3種模式可通過改變控制時序、離子阱的入口和出口電勢、激發(fā)頻率及幅值等參數(shù)來自由轉(zhuǎn)換。

1.1 真空系統(tǒng)

儀器采用四級差分真空系統(tǒng)，一級真空(大氣壓接口)壓強100 Pa，由1臺16 L/s的旋片式機械泵(SV65 BI，德國萊寶公司)來保證；二級真空(RFQ)壓強0.3 Pa，三級真空(LIT)壓強2×10-3Pa，四級真空(TOF)壓強2×10-4Pa，分別由1臺Hipace80分子泵、2臺Hipace300分子泵(德國Pfeiffer公司)及1臺6 L/s的旋片式機械泵(RVP-6，北京中科科儀公司)作為前級泵獲得所需的差分真空。每個真空區(qū)域各設(shè)一個真空規(guī)實時監(jiān)控。

1.2 線性離子阱(LIT)

LIT由一組四極桿及前后端蓋電極組成，通過施加在端蓋電極上的阻擋電勢，在LIT軸向上形成勢阱，從而將離子束縛住。四極桿上分別施加一組幅值相等、相位相差180°的射頻信號，其頻率為1 MHz、最大幅值為2 kVpp。其中一組電極上疊加有輔助射頻信號，用于離子阱掃描過程或CID過程時，輸出單頻正弦信號；用于離子質(zhì)量隔離時，輸出數(shù)字存儲傅立葉反變換波形(Stored waveform inverse Fourier transform，SWIFT)。

1.3 飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)

TOF采用垂直引入雙場加速反射式飛行時間結(jié)構(gòu)，由離子調(diào)制傳輸器、加速器、無場飛行區(qū)、反射器和離子檢測器構(gòu)成。推斥板與反射板距離僅550 mm，但離子的有效飛行距離達1.3 m。

圖2 LIT與TOF脈沖時序圖Fig.2 Pulse sequence diagram of LIT and TOF

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters

1.4 LIT與TOF聯(lián)動脈沖技術(shù)

LIT與TOF聯(lián)用時，離子引出方式為軸向引出，為提高離子利用率和儀器占空比，LIT端蓋電極脈沖與TOF的推斥脈沖采用聯(lián)動控制(如圖2所示)。將離子阱內(nèi)離子引出到TOF時，端蓋電極上的電壓由高電平變?yōu)榈碗娖?，相當于門開，離子被引出，此時同步產(chǎn)生一個5 VTTL信號給TOF脈沖板，經(jīng)過一定的延時(t1)后，脈沖板在推斥板上產(chǎn)生一串脈沖串，可通過設(shè)置不同的脈沖持續(xù)時間(t2)、脈沖周期(t5)調(diào)節(jié)施加的脈沖個數(shù)。通過將LIT端蓋電極脈沖與TOF的推斥脈沖聯(lián)動控制，根據(jù)目標離子的質(zhì)荷比大小，設(shè)置合適的脈沖延時(t1)，目標離子漂移至推斥區(qū)時，再施加推斥脈沖，可大大提高目標離子的利用率和儀器占空比。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

線性離子阱飛行時間質(zhì)譜儀LIT-TOF MS(自主研發(fā))；Sartorius萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；實驗標準品利血平(分析標準品，≥99.5%)、L-脯氨酸(分析標準品，99%)購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；質(zhì)譜標準物Ultramark1621(分析標準品)購于美國Alfa Aesar公司。

2.2 實驗方法

2.2.1標準溶液的配制分別準確稱取10 mg利血平、Ultramark1621和L-脯氨酸標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L的標準儲備液。分別從1 000 mg/L的利血平和Ultramark1621標準儲備液中移取10 μL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成100 μg/L的標準溶液。從1 000 mg/L的L-脯氨酸標準儲備液中分別移取1、5、10、50、100、200 μL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為10、50、100、500、1 000、2 000 μg/L的L-脯氨酸溶液。

2.2.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)，采集模式：正離子檢測模式，霧化氣：氮氣(純度99.999%)，樣品進樣流速為5 μL/min。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

3 結(jié)果與討論

3.1 性能表征

3.1.1質(zhì)量分辨率分別取100 μg/L的利血平標準溶液和Ultramark1621標準溶液，儀器設(shè)置為TOF模式，得到m/z609的[C33H41N2O9]+(利血平離子)和m/z1 222的[C24H19O6N3P3F36]+(Ultramark1621離子)的質(zhì)量分辨率分別為13 367(圖3A)和15 549(圖3B)。

3.1.2質(zhì)量范圍分別取純甲醇和100 μg/L的 Ultramark1621標準溶液，儀器設(shè)置為TOF模式，最小可測到m/z33的[CH3OH+H]+峰(圖4A)，其信噪比大于10；最大可檢測到m/z1 922的[C38H19O6N3P3F64]+峰(圖4B)，其信噪比大于3。

3.1.3靈敏度分別取純甲醇(空白)和1 μg/L的利血平標準溶液，儀器設(shè)置為Trap模式，以5 μL/min流速進樣，得到儀器的靈敏度譜圖如圖5所示。圖中可見明顯的譜峰，噪音水平小于5，主峰信噪比S/N>10。

3.1.4多級質(zhì)譜取100 μg/L利血平標準溶液，儀器設(shè)置為Trap模式，得到利血平的一級譜圖如圖6A所示。開啟LIT-TOF聯(lián)用模式，設(shè)置輔助射頻信號為SWIFT混頻模式，SWIFT頻率缺口中心頻率為125 kHz(RF頻率1 MHz，幅值600 Vpp，場徑5.22 mm)，對母離子m/z609進行捕獲，隔離窗口為±3 amu時，目標離子的隔離效率≥80%(圖6B)。設(shè)置CID過程中輔助射頻信號為頻率124.5 kHz、幅度0.35 Vpp的單頻正弦信號，對母離子進行激發(fā)，產(chǎn)生碎片離子m/z448、397、195，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)效率≥80%，得到利血平的二級譜圖(圖6B插圖)。繼續(xù)設(shè)置輔助射頻信號為SWIFT混頻模式，SWIFT頻率缺口中心頻率為113 kHz(RF頻率1 MHz，幅值400 Vpp，場徑5.22 mm)，對母離子m/z448進行捕獲，隔離窗口為±3 amu時，目標離子的隔離效率≥80%。設(shè)置CID過程中輔助射頻信號為頻率112.5 kHz、幅度0.35 Vpp的正弦信號，對碎片離子m/z448進行激發(fā)，產(chǎn)生碎片離子m/z195、236，CID效率≥80%，得到利血平的三級譜圖如圖6C所示。

圖6 利血平離子的一級質(zhì)譜圖(A)、二級質(zhì)譜圖(B)、三級質(zhì)譜圖(C)Fig.6 MS spectrum of reserpine(A)，MS/MS spectra of reserpine(B)，MS3 spectra of reserpine(C)

圖7 L-脯氨酸的質(zhì)譜圖Fig.7 MS spectrum of L-prolineinsert：MS/MS spectrum of L-proline

3.2 氨基酸檢測

氨基酸的常規(guī)檢測手段包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)[15]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)[16]及毛細管電泳(Capillary electrophoresis，CE)[17]，這些檢測方法由于需進行繁瑣而費時的預(yù)處理，難以實現(xiàn)對大量樣品的快速檢測[18]。而LIT-TOF MS結(jié)合大氣壓電離源可對復(fù)雜基體樣品進行直接檢測，無需預(yù)處理，非常適用于氨基酸的直接快速檢測。因此，本研究以L-脯氨酸作為檢測樣品進行初步的應(yīng)用分析。分別取空白(純甲醇)，以及質(zhì)量濃度分別為10、50、100、500、1 000、2 000 μg/L的L-脯氨酸標準溶液，在LIT-TOF聯(lián)用模式下，記錄L-脯氨酸碎片離子[M+H-CO-H2O]+(m/z70)(圖7)的峰面積，以峰面積(y)對樣品質(zhì)量濃度(x，μg/L)進行回歸分析。結(jié)果顯示，L-脯氨酸在10～2 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性，其線性方程為y=0.446x+16.367，r2=0.991。表明LIT-TOF MS可為代謝組學(xué)研究中實時、在線、高通量測定生物復(fù)雜樣品中氨基酸的含量及其變化提供一定依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究設(shè)計并搭建了一款線性離子阱飛行時間質(zhì)譜儀LIT-TOF MS，開發(fā)了LIT與TOF的聯(lián)動脈沖技術(shù)。以電噴霧離子源對儀器的性能指標進行測試，結(jié)果表明，儀器的整體性能優(yōu)異：儀器質(zhì)量分辨率為13 367(m/z609)及15 549(m/z1 222)，質(zhì)量檢測范圍為m/z33～1 922，靈敏度為1 μg/L，能夠?qū)崿F(xiàn)離子碎裂、離子儲存和MS3三級質(zhì)譜分析等功能。該儀器集成了線性離子阱的高容量、多級質(zhì)譜能力和飛行時間質(zhì)譜高速、高分辨的能力，結(jié)合大氣壓電離技術(shù)，可對復(fù)雜基體樣品進行直接檢測，無需預(yù)處理，在藥品、環(huán)境、食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。