郝 哲，張建幫，李曉明，王麗軍，劉 棟，程艷芹，李明春

［作者單位］450042河南鄭州，原解放軍153醫(yī)院制劑室（郝哲，張建幫，李曉明，王麗軍，劉棟）；266071山東青島，原解放軍401醫(yī)院制劑室（程艷芹，李明春）

板柴口服液來(lái)源于筆者所在醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方，由板藍(lán)根、柴胡、金銀花、大青葉和魚(yú)腥草組成，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、利咽消腫的功效，用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛等癥。板藍(lán)根是傳統(tǒng)的抗病毒中藥之一，作為方中主藥，很好地發(fā)揮了其清熱解毒的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，板藍(lán)根中的（R，S）－告依春有明顯的抗流感病毒作用［1］，是板藍(lán)根抗病毒的代表性有效成分之一，也是反映板藍(lán)根藥材質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)［2］。原標(biāo)準(zhǔn)僅采用薄層色譜法對(duì)板藍(lán)根和柴胡進(jìn)行定性鑒別，標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)滯后，為進(jìn)一步有效控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，該實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了薄層色譜條件，對(duì)板藍(lán)根、大青葉和柴胡3種藥材進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法對(duì)該制劑中R，S－告依春進(jìn)行含量測(cè)定，該次研究擬為軍隊(duì)醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升邁入一個(gè)新臺(tái)階提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器島津LC－10A高效液相色譜儀；BT－125D型電子天平（賽多利斯有限公司）；KQ－50E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥柴胡皂苷a對(duì)照品 （批號(hào)110777－201108，含量為90.5%）；靛玉紅對(duì)照品 （批號(hào)110717－200204）；R，S－ 告 依 春 對(duì) 照 品 （ 批 號(hào)111753－201304，含量為 99.9%）；柴胡對(duì)照藥材（批號(hào) 120992－201108）； 大青葉對(duì)照 藥 材 （批 號(hào)121367－200602）； 板藍(lán)根對(duì)照藥材 （批號(hào)121177－201306），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。板柴口服液 （中國(guó)人民解放軍第一五三中心醫(yī)院自制，批號(hào)：150312，150327，150506）；陰性樣品自制；甲醇為色譜純（天津四友），水為自制蒸餾水，其他試劑均為分析純。硅膠G薄層板（上海海洋化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 柴胡的 TLC 鑒別［3－5］取本品 10 ml，加水20 ml，用水飽和的正丁醇萃取2次，30 ml/次，合并正丁醇液，用氨試液30 ml洗滌1次，取正丁醇層，蒸干，殘?jiān)右掖? ml溶解，作為供試品溶液。另取不含柴胡的陰性樣品10 ml，同法制成陰性對(duì)照溶液。再取柴胡皂苷a對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再取柴胡對(duì)照藥材 0.2 g，加乙醇 5 ml，超聲 10 min，濾過(guò)，作為柴胡對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法《中國(guó)藥典》四部通則0502（2015年版）吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各 10 μl，對(duì)照品溶液及對(duì)照藥材溶液各 5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－乙醇－水（8∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%對(duì)二甲氨基苯甲醛40%硫酸溶液，60℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1 柴胡的薄層鑒別圖

2.1.2 板藍(lán)根、 大青葉的TLC鑒別［6－9］取本品30 ml，用二氯甲烷萃取2次，30 ml/次，合并二氯甲烷液，用1%NaOH溶液洗滌2次，20 ml/次，取二氯甲烷層，濃縮至約1 ml，作為供試品溶液。另取不含板藍(lán)根、大青葉的陰性樣品30 ml，同法制成陰性對(duì)照溶液。再取大青葉對(duì)照藥材0.2 g，加二氯甲烷5 ml，超聲20 min，濾過(guò)，即得大青葉對(duì)照藥材溶液；再取板藍(lán)根對(duì)照藥材5 g，加乙酸乙酯50 ml，回流2 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)佣燃淄?.5 ml使溶解，即得板藍(lán)根對(duì)照藥材溶液。另取靛玉紅對(duì)照品，加二氯甲烷制成每1 ml含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法《中國(guó)藥典》四部通則0502（2015年版）吸取上述七種溶液各 10 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯（3∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖 2 板藍(lán)根、大青葉的薄層鑒別

2.2 R，S-告依春含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)［6］采用HPLC法，色譜柱：Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.02%磷酸溶液（7∶93）；流速 1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μl。理論塔板數(shù)按R，S－告依春峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取板柴口服液5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取R，S－告依春對(duì)照品10.26 mg，精密稱定，至100 ml量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度為0.1025 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得41.00 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺板藍(lán)根的陰性樣品5 ml，按照2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，分別按上述色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果樣品峰與其他組分良好分離，陰性樣品無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取R，S－告依春對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（0.1025 mg/ml）1 ml，2 ml，4 ml，6 ml，8 ml置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，吸取10 μl注入色譜儀，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度 μg/ml（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得 R，S－告依春回歸方程為：Y=72227X－39176，r=0.9999 （n=5）。結(jié)果表明，R，S－告依春在 10.25～82 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖 3 R，S-告依春HPLC圖

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣 6 次，記錄峰面積，結(jié)果 R，S－告依春峰面積的RSD為0.54%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品 （批號(hào)：150312）6份，按2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果樣品中R，S－告依春平均含量為63.18 μg/ml，RSD為0.81%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.2.8項(xiàng)下1號(hào)供試品溶液，按 2.2.1 項(xiàng)下色譜條件，分別在 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果R，S－告依春峰面積的RSD為1.04%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的樣品9份各2.5 ml，分別精密加入R，S－告依春對(duì)照品溶液（41.00 μg/ml），3.0 ml，3.8 ml，4.6 ml，各平行 3份；按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.11 含量測(cè)定 取3批板柴口服液 （批號(hào)分別為 150312，150327，150506）， 每批各 3 份， 按照2.2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，依法進(jìn)行含量測(cè)定。由表2見(jiàn)，三批板柴口服液中R，S－告依春含量的均值為62.43 μg/ml，取其80%作為本標(biāo)準(zhǔn)的含量下限，為 49.94 μg/ml，即每 1 ml板柴口服液中含 R，S－告依春以（C5H7NOS）計(jì)，不得少于 49 μg。

3 討論

薄層色譜研究中，避免使用對(duì)人體及環(huán)境有害的三氯甲烷等試劑，所選試劑有利于環(huán)保。查閱大量文獻(xiàn)［6－8］，鑒別板藍(lán)根時(shí)多選用精氨酸作為對(duì)照品，但經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根，柴胡，大青葉三者均含有精氨酸，專屬性不強(qiáng)。曾嘗試對(duì)該制劑中R，S－告依春進(jìn)行薄層鑒別，但展開(kāi)效果不理想。板藍(lán)根和大青葉來(lái)源于同一植物的不同部位，經(jīng)多次試驗(yàn)，二者均含有靛玉紅［9，10］，最終選擇靛玉紅作為對(duì)照品，來(lái)鑒別二者。因板藍(lán)根為方中主藥，故保留此鑒別方法。曾對(duì)該制劑中臣藥金銀花和魚(yú)腥草進(jìn)行薄層鑒別，因二者均含有綠原酸［11，12］，陰性互相干擾，未采用。

在R，S－告依春含量測(cè)定中，有文獻(xiàn)報(bào)道，以水為提取溶劑［13］，該文比較了甲醇、乙醇、水 3種溶劑，結(jié)果三者提取率相差不多，但以水為溶劑，雜質(zhì)峰較多，基線不穩(wěn)，而以甲醇為溶劑提取，可醇沉除去部分雜質(zhì)，雜質(zhì)峰較少，基線更為平穩(wěn)，主峰分離度更好，故選擇甲醇為提取溶劑。該課題組曾對(duì)本制劑中綠原酸進(jìn)行了含量測(cè)定研究［11，12］，但經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)，該制劑在放置6個(gè)月后，綠原酸含量明顯下降，原因是綠原酸不穩(wěn)定易分解，故未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表 1 R，S-告依春加樣回收試驗(yàn)（n=9）

表 2 三批樣品的含量測(cè)定結(jié)果

在制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)考慮有效成分轉(zhuǎn)移率的問(wèn)題，一般以＞30%為宜。如果轉(zhuǎn)移率太低，由于中藥材質(zhì)量參差不齊，可能會(huì)導(dǎo)致制劑中有時(shí)無(wú)法測(cè)到該成分或者含量達(dá)不到所定標(biāo)準(zhǔn)。在該試驗(yàn)中，三批樣品R，S－告依春的轉(zhuǎn)移率分別為53.4%；50.8%；54.7%，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定可行，故選取該成分納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，該實(shí)驗(yàn)建立的R，S－告依春HPLC含量測(cè)定方法，簡(jiǎn)便易行，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于本制劑的質(zhì)量控制。