張海艷

摘 要：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)是一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，具有較強(qiáng)特異性，并且操作快速簡單，具有較高的靈敏度。目前，此技術(shù)被廣泛應(yīng)用到多方面，并且具有一定的改進(jìn)，主要為多重環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和其他技術(shù)的聯(lián)合使用。該文對環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用進(jìn)行分析，從而為環(huán)介導(dǎo)等溫技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；食品檢測；微生物檢測

中圖分類號 TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）21-0041-03

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）為Notomi等人所發(fā)現(xiàn)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，其避免了不必要的環(huán)節(jié)，節(jié)約時間，并且具有較高的靈敏度。LAMP技術(shù)利用2對特異性引物實(shí)現(xiàn)目的序列6個區(qū)域的退火雜交，通過Bst DNA聚合酶催化作用，基于恒溫條件中溫育30～60min，能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)序列批量的擴(kuò)增。其反應(yīng)結(jié)果能夠直接通過肉眼觀察是否具有白色焦磷酸鎂沉淀，從而進(jìn)行判斷，還能夠添加羥基酚藍(lán)、鈣黃綠素等熒光染料實(shí)現(xiàn)顯色觀察。常規(guī)PCR與實(shí)時定量PCR技術(shù)是現(xiàn)在使用較為廣泛的分子生物學(xué)檢測方法，但是因?yàn)镻CR方法操作過程較為繁瑣，并且時間較長，對于儀器設(shè)備具有較高的要求，不能夠在臨床快速檢測中使用。但是LAMP技術(shù)具有較強(qiáng)的特異性，并且具有較高的靈敏度，不需要昂貴儀器，能夠在現(xiàn)場病原體及基層檢測中使用。目前，該方法被逐漸改進(jìn)，也被廣泛應(yīng)用到食品微生物檢測過程中。

1 LAMP的技術(shù)原理

雙鏈DNA在65℃左右為動態(tài)平衡的狀態(tài)，任何引物和雙鏈DNA互補(bǔ)的部位實(shí)現(xiàn)堿基互補(bǔ)配對延伸的過程中，另外1條鏈就會脫落成為單鏈，LAMP的方法就是通過DNA此種特點(diǎn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。

LAMP方法4個引物指的是針對靶基因中的6個區(qū)域?qū)崿F(xiàn)設(shè)計(jì)的，此6個區(qū)域在3′端F3c區(qū)段、F2c區(qū)段、F1c區(qū)段及處于5′端的B1區(qū)段、B2區(qū)段及B3區(qū)段（圖1）。LAMP方法的2條內(nèi)引物FIP與BIP，F(xiàn)IP包括TTTT連接子、F1c序列及F2序列，BIP包括TTTT連接子、B1c序列、B2序列，2條外引物分別為F3和B3序列。LAMP引物設(shè)計(jì)不僅要避免引物二聚體的形成、引物自身的互補(bǔ)及3，端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，對于引物距離也具有一定的要求。F3和F2之間、B2和B3之間距離為0～20bp，引物中環(huán)的距離為40～60bp，LAMP反應(yīng)擴(kuò)增區(qū)域距離為120～180bp[1]。

LAMP等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)體系一般為25μL，包括引物、模板DNA、dNTPs、BstDNA聚合酶及緩沖液。其中的內(nèi)引物濃度為0.8～2.0μmol/L，外引物的濃度為0.2～0.8μmol/L，鎂離子的濃度為2～10mmol/L。不同物質(zhì)混合之后，放到60～65℃中保溫60～90min，80℃滅活10min，產(chǎn)物通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，并且肉眼觀察反應(yīng)體系濁度變化[2]。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的優(yōu)勢

2.1 特異性較高 由于LAMP技術(shù)設(shè)計(jì)的4對引物是將病原微生物特異性基因靶核酸序列作為基礎(chǔ)，能夠有效識別靶基因中的6個特異序列，將其進(jìn)行結(jié)合能夠?qū)е聰U(kuò)增效應(yīng)的發(fā)生，反應(yīng)混合物中非靶基因DNA并不會被其影響。LAMP一般能夠檢測RCR中1/100拷貝數(shù)，具有較高的檢測靈敏度，因此LAMP的靈敏度及特異性較高。

2.2 反應(yīng)時間較短 LAMP是在恒溫條件下擴(kuò)增反應(yīng)，在1h之內(nèi)能夠?qū)⑷糠磻?yīng)實(shí)現(xiàn)，與PCR反應(yīng)過程中的溫度循環(huán)并不相同，假如將2條環(huán)引物添加到反應(yīng)體系中，能夠縮短反應(yīng)時間。對比PCR方法，LAMP方法反應(yīng)時間比較短，使用非常簡單，能夠滿足快速檢測的需求[3]。

2.3 檢測方便 通過LAMP實(shí)現(xiàn)多種莖狀DNA的合成，并且產(chǎn)生大量焦磷酸根離子，將鎂離子添加到反應(yīng)溶液中，能夠產(chǎn)生白色焦磷酸鎂沉淀，利用肉眼就能對其進(jìn)行觀察，或者使用濁度儀在400nm光中對濁度進(jìn)行檢測，就能夠?qū)κ欠駭U(kuò)增進(jìn)行檢測。PCR雖然能夠產(chǎn)生焦磷酸鹽或者磷酸鹽離子，但是產(chǎn)生的量比較少，無法用于檢測。LAMP方法也能夠通過生成的焦磷酸鎂沉淀量結(jié)合DNA生成量的線形關(guān)系，對DNA進(jìn)行定性及定量分析。

2.4 操作較為簡單 LAMP反應(yīng)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)是在等溫條件中進(jìn)行，對比PCR較為簡單，只需要實(shí)驗(yàn)室具有水浴鍋，直接檢測反應(yīng)后的產(chǎn)物就能夠判斷，不需要復(fù)雜設(shè)備和試劑，在快速檢測及現(xiàn)場檢測過程中非常有利[4]。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食物檢測中的使用

3.1 在食源致病菌中的檢測 LAMP技術(shù)在食源致病菌檢測過程中應(yīng)用較多，并且方法較為成熟。LAMP在大腸桿菌研究中使用較為廣泛并且成熟，對于不同類型的大腸桿菌使用不同的靶序列設(shè)計(jì)引物實(shí)現(xiàn)專門檢測。研究人員通過大腸桿菌不耐熱腸毒素LT基因保守區(qū)實(shí)現(xiàn)引物的設(shè)計(jì)，創(chuàng)建LAMP技術(shù)快速檢測的方法。針對肉類中的大腸桿菌O157：H7，利用其特異性抗原rfbE基因和鞭毛H7特異性抗原flic基因成為靶序列，實(shí)現(xiàn)環(huán)引物改良LAMP引物序列的設(shè)計(jì)，從而創(chuàng)建快速檢測方法，肉眼就能夠觀察結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)單管的同時檢測。

多類別沙門氏菌能夠?qū)е氯诵缶植康母腥拘曰?，從而出現(xiàn)敗血癥或者死亡。研究人員通過沙門氏菌高度保守fimY基因靶序列實(shí)現(xiàn)引物設(shè)計(jì)，創(chuàng)建LAMP反應(yīng)體系。陽性菌株檢測率為100%，此技術(shù)對檢測牛奶沙門氏菌污染具有一定的靈敏度[5]。

葡萄球菌屬于革蘭式陽性球菌，部分致病并且為較常見的化膿性球菌。最為常見的就是金黃色葡萄球菌，此菌種LAMP檢測方法比較多，可以通過創(chuàng)建LAMP方法檢測豬血中金黃色葡萄球菌。凝固酶陽性葡萄球菌會導(dǎo)致人局部化膿性感染，還會出現(xiàn)敗血癥、肺炎等疾病。針對此菌種特有coa基因?qū)崿F(xiàn)引物的設(shè)計(jì)，能夠創(chuàng)建具有良好特異性及較高檢出率的LAMP檢測方法。

阪崎腸桿菌會導(dǎo)致新生兒小腸結(jié)腸炎、腦膜炎等，并且具有較高的感染率及死亡率。通過阪崎腸桿菌16S-23SrDNA間區(qū)序列實(shí)現(xiàn)特異性引物的設(shè)計(jì)，并且創(chuàng)建LAMP檢測方法，此種方法在實(shí)現(xiàn)奶粉樣品阪崎腸桿菌檢測過程中的低限為1.2CFU/100g。

副溶血性孤菌是在各種水產(chǎn)品寄生的有害菌，也是導(dǎo)致人類食物中毒的主要病原體。結(jié)合LAMP技術(shù)和疊氮溴化乙錠染色，通過副溶血性孤菌tlh基因成為靶序列實(shí)現(xiàn)特異性引物的設(shè)計(jì)，創(chuàng)建快速食品副溶血性孤菌檢測的方法，通過此種方法還能夠檢測克氏蟞蝦寄生副溶血性孤菌，其結(jié)果和國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法相同[6]。

3.2 在食源致病病毒中的檢測 食源病毒主要在家畜、家禽、蔬菜、水產(chǎn)等活體中寄存，會導(dǎo)致活體大量死亡，從而造成經(jīng)濟(jì)損失。禽流感病毒（AIV）會導(dǎo)致出現(xiàn)禽類流感，給養(yǎng)禽業(yè)造成較大的損失。此病毒為RNA病毒，主要包括16個HA亞型，此亞型能夠?qū)θ嗽斐筛腥?，或者還會導(dǎo)致死亡。LAMP技術(shù)對禽流感病毒檢測過程中具有較高的靈敏度，能夠在大規(guī)模農(nóng)場家禽感染檢測過程中使用。對于H1N1亞型禽流感病毒HA基因及M基因?qū)崿F(xiàn)2組特異性引物的設(shè)計(jì)，并且實(shí)現(xiàn)LAMP單管快速檢測方法的創(chuàng)建，反應(yīng)結(jié)果利用濁度實(shí)現(xiàn)判斷，最低能夠?qū)?0拷貝/管病毒顆粒進(jìn)行檢測[7]。

除了禽流感之外，LAMP還能夠在其他禽類病毒檢測過程中使用。鵝副黏病毒會導(dǎo)致鵝消化道傳染病，通過此病毒F基因?qū)崿F(xiàn)引物設(shè)計(jì)，創(chuàng)建LAMP檢測方法。禽呼腸孤病毒會導(dǎo)致禽類肝炎、心包炎等疾病，對于此病毒p10基因?qū)崿F(xiàn)引物設(shè)計(jì)，創(chuàng)建使用鈣黃綠色熒光顯示結(jié)果的LAMP檢測。

3.3 在轉(zhuǎn)基因食品中的檢測 目前對于是否推廣使用轉(zhuǎn)基因食品具有一定的爭議，實(shí)現(xiàn)靈敏轉(zhuǎn)基因食品檢測方法的創(chuàng)建尤為重要。LAMP技術(shù)在此方面能夠充分發(fā)揮作用，其檢測轉(zhuǎn)基因食物靶基因?yàn)楸晦D(zhuǎn)化基因的自身，也就是轉(zhuǎn)基因最常使用的啟動子。大部分轉(zhuǎn)基因食物中都具有CaMV-35S啟動子，所以對其啟動子檢測就能夠判斷此食物是否屬于轉(zhuǎn)基因。對于人工改造光源cry1Ac基因?qū)崿F(xiàn)LAMP特意引物的設(shè)計(jì)，并且通過熒光杏色使用轉(zhuǎn)基因水稻的檢測[8]。

3.4 在食品過敏原成分的檢測 食物過敏是導(dǎo)致腸道、皮膚和呼吸道等多種急性疾病的主要原因，目前對過敏癥的治療主要方法就是避免食用具有過敏原的食物，要求生產(chǎn)商在食物標(biāo)簽中將導(dǎo)致過敏成分進(jìn)行標(biāo)識，避免消費(fèi)者在不知情的情況下誤食導(dǎo)致過敏。目前，國內(nèi)外常用檢測食品過敏原成分方法主要包括核酸檢測及免疫學(xué)檢測[9]。核酸檢測具有快速、靈敏及精準(zhǔn)的優(yōu)勢，通過深加工的食品，核酸成分還是具有一定穩(wěn)定性，所以其成為主要檢測基礎(chǔ)。將8種食物過敏原中的典型產(chǎn)品作為研究對象，對實(shí)現(xiàn)具有較高特異性的過敏原基因片段進(jìn)行篩選，將其作為檢測對象，實(shí)現(xiàn)LAMP引物的設(shè)計(jì)，并且實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的優(yōu)化，創(chuàng)建快速檢測食品過敏原成分的方法。以過敏原小麥成分檢測為例，選擇GAG56D基因高特異性片段，設(shè)計(jì)4條LAMP引物及2條環(huán)引物，在65℃中實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增1h，使用SYBR GreenI作為熒光染料，在反應(yīng)結(jié)束之后，陰性結(jié)果為橙色，陽性結(jié)果為綠色。此方法的靈敏度為0.01%，實(shí)現(xiàn)50份樣品的檢測，分別為29份小麥原料樣品、23份小麥加工制品、7份沒有小麥成分的樣品，結(jié)果和實(shí)時熒光定量PCR相同，符合率為100%，能夠縮短檢測的時間，操作較為簡單[10]。

4 結(jié)語

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種較為便捷、快速的核酸檢測方法，和實(shí)時熒光定量PCR方法及常規(guī)PCR方法相同，都是食品安全檢測的主要工具。目前，我國已經(jīng)具有基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的食品檢測標(biāo)準(zhǔn)，比如出口食品中轉(zhuǎn)基因成分環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法及進(jìn)出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法。與傳統(tǒng)PCR方法對比，LAMP的主要優(yōu)勢為反應(yīng)時間較短，不需要昂貴的PCR儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)單一樣品多種靶基因的同時檢測等。LAMP技術(shù)還可以進(jìn)一步完善及優(yōu)化，比如多種LAMP設(shè)計(jì)、與芯片技術(shù)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)靈敏、特異、快速及高通量的目的，成為檢測核酸、微病菌及微生物的主要工具，被廣泛應(yīng)用到衛(wèi)生防疫、食品安全檢測等領(lǐng)域，具有廣闊的前景。

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（責(zé)編：徐世紅）