張琰 石玉波

摘 要：根據(jù)前期百子蓮（Agapanthus praecox ssp.orientalis）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的結(jié)果，獲得了1個(gè)與胚性能力相關(guān)的關(guān)鍵基因Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1（SERK1）同源性較高的核心片段。采用cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）方法得到了百子蓮SERK基因cDNA全長序列，命名為ApSERK1。序列分析表明，百子蓮ApSERK1基因開放閱讀框（ORF）為1800bp，編碼1個(gè)含有600個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。氨基酸同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，百子蓮ApSERK1蛋白序列與水稻、小蘭嶼蝴蝶蘭、鐵皮石斛、椰子樹和菠蘿等植物蛋白序列的相似性可達(dá)到90%以上。實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR結(jié)果表明，ApSERK1基因有一定時(shí)空表達(dá)差異，在百子蓮的種子、小花梗中表達(dá)含量最高，且隨著外源生長素濃度的增加，胚性愈傷組織的胚性能力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。推測(cè)ApSERK1基因是衡量植物細(xì)胞胚性能力的重要指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：百子蓮；體細(xì)胞發(fā)育受體激酶；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S682.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）21-0036-05

Molecular Cloning and Expression Analysis of Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1 in Agapanthus praecox

Zhang Yan et al.

（1Shanghai Vocational Technical College of Agriculture and Forestry，Shanghai 201600，China）

Abstract：A core fragment highly homologous with the key gene of embryo ability pathway， Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1（SERK1 was obtained on the basis of preliminary Agapanthus praecox ssp. orientalis transcriptome sequencingresults. The full length sequence of cDNA， the SERK1 gene of A. praecox was gained by the RACE method， which was named ApSERK1 . The results of sequence analysis showed that the full length of cDNA was 1800bp， which was composed of 600 encoded amino acids.The amino acid homology comparison found that the ApSERK1 protein sequence of baizilian could be more than 90% similar to the plant protein sequences of rice， xiaolangyu butterfly orchid， dendrobium candidum， coconut tree and pineapple.The results of real-time quantitative PCR showed that ApSERK1 gene had a certain temporal and spatial expression difference， with the highest expression content in the seed and floret stalk， and the germinal capacity of embryonal callus decreased with the increase of exogenous auxin concentration.It is speculated that ApSERK1 gene is an important indicator of the embryonic ability of plant cells.

Key words：Agapanthus praecox ssp. orientalis；Somatic cell Receptor kinase；Gene cloning；Expression analysis

基于德國植物生理學(xué)家Haberlandt（1902）提出的細(xì)胞全能性（Cell Totipotency）理論[1]，植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生（Somatic Embryogenesis，SE）是指在離體培養(yǎng)條件下，單倍體或雙倍體的體細(xì)胞向類似合子胚的體細(xì)胞胚胎（Somatic Embryos）發(fā)生方式轉(zhuǎn)變，并發(fā)育成新個(gè)體的形態(tài)發(fā)生過程[2]。自從1958 年英國生物學(xué)家F.C.Steward和J.Reinert分別以胡蘿卜的根系作為外植體成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞再生植株以來[3]，目前在裸子植物、雙子葉植物、單子葉植物中已有300多種植物利用其莖段、下胚軸、子葉、葉片、葉柄、果肉、花芽、根、合子胚、胚乳等作為外植體建立了SE 技術(shù)體系[4]。體細(xì)胞發(fā)育受體激酶 SERK（Somatic Embryogenesis Recepotor Kinase）基因無疑是檢驗(yàn)植物體細(xì)胞體系建立的1個(gè)關(guān)鍵性基因。1997年Schmidt等首先從胡蘿卜懸浮胚性細(xì)胞中檢測(cè)出DcSERK基因的差異表達(dá)，并將其作為胚性能力檢驗(yàn)的首要分子標(biāo)記物[5]。Hecht等（2008）也從擬南芥中克隆了定位于亞細(xì)胞的膜蛋白基因AtSERK1～ AtSERK5，推斷SERK在某個(gè)節(jié)點(diǎn)上與SE激素信號(hào)通路之間相互作用[6]。

百子蓮（Agapanthus praecox ssp. orientalis）又稱藍(lán)百合，為百子蓮科百子蓮屬的單子葉多年生球根花卉，原產(chǎn)于非洲南部的熱帶與亞熱帶地區(qū)。百子蓮屬植物花序碩大、花色優(yōu)雅、株形整齊，觀賞性很強(qiáng)，是國外植物造景中常用的植物資源。我國最早于2002年將百子蓮引入上海，研究中發(fā)現(xiàn)其花芽分化時(shí)受到溫度影響結(jié)實(shí)率很低[7]，因此建立了百子蓮體細(xì)胞培養(yǎng)體系（Somatic Embryogenesis，EC）[8]。SERK作為體細(xì)胞胚胎發(fā)育的關(guān)鍵基因，在單子葉植物百子蓮及其體細(xì)胞發(fā)育的研究中還沒有報(bào)道。筆者克隆得到了百子蓮體細(xì)胞受體激酶APSERK1，并利用實(shí)時(shí)熒光定量分析的方法，對(duì)百子蓮不同發(fā)育時(shí)期各組織、不同體細(xì)胞中的APSERK1進(jìn)行了相對(duì)定量表達(dá)分析，為進(jìn)一步了解SERK在百子蓮體細(xì)胞發(fā)育過程中的表達(dá)模式和作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)材料為2002年由南非引入我國上海地區(qū)的百子蓮（Agapanthus praecox ssp.orientalis），取百子蓮胚性愈傷組織（EC）提取總RNA，進(jìn)行cDNA的RACE擴(kuò)增。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 cDNA核心序列的獲得 根據(jù)前期百子蓮轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果，得到百子蓮SERK（1749bp）同源基因的核心序列，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物3-GSP1和3-GSP2、5-GSP1和5-GSP2。以百子蓮胚性愈傷組織（EC）的cDNA為模板進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，引物序列見表1。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、60～65℃退火30s、72℃延伸30～90s（視產(chǎn)物片段大小而定），35個(gè)循環(huán)；72℃保持5min，使產(chǎn)物延伸完整。反應(yīng)程序結(jié)束后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（120V，30min），觀察條帶位置與亮度，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。

1.2.2 SERK基因全長克隆 以提取百子蓮胚性愈傷組織的總RNA為模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行3′RACE和5′RACE cDNA文庫的構(gòu)建。以SERK-F1、UPM和SERK-R1、UPM作為3′ RACE和5′RACE擴(kuò)增的第1輪引物，根據(jù)獲得的目的片段序列，使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)3′RACE巢式PCR引物SERK-F2和SERK-F3，以百子蓮3′RACE cDNA文庫（1μL）為模板，按SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）擴(kuò)增試劑盒說明書進(jìn)行操作，獲得3′端序列。將獲取的目的片段序列和3′ RACE序列拼接后，設(shè)計(jì)5′RACE巢式PCR引物SERK-R2，按上述擴(kuò)增試劑盒說明書操作，獲得5′端序列。將3′端序列、中間目的片段序列和5′端序列拼接后，設(shè)計(jì)SERK基因全長特異性引物SERK-F1和SERK-R3，通過PCR擴(kuò)增，克隆、測(cè)序，獲得該基因全長序列。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用NCBI網(wǎng)站上的BLASTx程序進(jìn)行序列相似性分析；使用GenBank ORFfinder和在線網(wǎng)站（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）進(jìn)行開放閱讀框的預(yù)測(cè)以及蛋白1級(jí)結(jié)構(gòu)（理論等電點(diǎn)和分子量）的分析；應(yīng)用DNAman軟件進(jìn)行同源性比較分析；利用瑞士模型預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白3級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。

1.2.4 熒光定量PCR 通過實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR方法分析SERK在不同發(fā)育階段、不同組織中的表達(dá)情況。使用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物qSERK-F和qSERK-R。利用FTC-3000TMSYSTEM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq II（2X）10μL、primer（10μm）各0.5μL、cDNA 2.0μL、RNase-free H2O up to 20μL。反應(yīng)程序設(shè)置94℃預(yù)變性60s；94℃變性10s，56℃退火15s，72℃延伸25s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用2-ΔΔCt法[9]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所用百子蓮內(nèi)參基因?yàn)锳ctin。所有樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取與APSERK1基因核心片段的獲得 RNA的質(zhì)量是決定基因克隆成敗的關(guān)鍵，高純度完整的RNA是基因克隆的基礎(chǔ)和保障。以百子蓮胚性愈傷組織作為試驗(yàn)材料，進(jìn)行RNA的提取，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以期望得到較為全面的轉(zhuǎn)錄信息。試驗(yàn)選用上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司的Trizol試劑提取百子蓮總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28s、18s和5s條帶清晰，且28s、18s條帶之間無明顯彌散現(xiàn)象，28s是18s亮度的2倍左右，表明提取的總RNA樣品較完整，無明顯降解現(xiàn)象（圖1a）。用Thermo NanoDrop1000 微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量A260/A280 比值為2.07，比值在2.0左右；A260/A230 比值分別為2.24，比值大于2，濃度為1562.0ng/μL，說明此方法提取的RNA樣品純度較高，可用于繼續(xù)開展后續(xù)試驗(yàn)。

根據(jù)百子蓮轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，得到了百子蓮ApSERK1基因片段762 bp，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)1組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到單一目的條帶的產(chǎn)物。序列經(jīng)BLASTp分析表明，該片段與多種植物的SERK基因具有很高的同源性，推定其為百子蓮APSERK1基因片段（圖1b）。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)確定的目的片段分別進(jìn)行后續(xù)的3，5RACE。

2.2 APSERK1基因的全長序列獲得 通過3′RACE第2輪和第3輪巢式PCR分別獲得1081bp和885bp（圖2）的cDNA片段，拼接后得到3′RACE945bp的cDNA片段。5′RACE經(jīng)兩輪巢式PCR后獲得1814bp（圖3）的cDNA片段，將3′RACE序列、核心序列和5′RACE獲得的序列進(jìn)行比對(duì)拼接后，得到2332bp的SERKcDNA全長序列，其中A、T、G、C4種堿基含量分別為26.8%（A）、28.47%（T）、24.5%（G）和20.15%（C）。經(jīng)NCBI的ORF Finder分析，ApSERK1基因開放閱讀框（ORF）為1800bp，編碼1個(gè)含有600個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（圖4）。

2.3 APSERK1氨基酸序列分析 運(yùn)用Protparam網(wǎng)站對(duì)百子蓮ApSERK1進(jìn)行了相關(guān)理化性質(zhì)分析，推斷出ApSERK1蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為160.59kD，等電點(diǎn)（pI）為4.94。對(duì)預(yù)測(cè)的ApSERK1蛋白序列2級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，ApSERK1中含有52.54%的ɑ-螺旋、30.14%的無規(guī)則卷曲、3.21%的β-轉(zhuǎn)角和14.11%的延伸鏈。圖5所示為百子蓮ApSERK1蛋白序列的3級(jí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.4 APSERK1的同源性比較 運(yùn)用NCBI網(wǎng)站上的BLASTx軟件對(duì)ApSERK1進(jìn)行同源性序列比對(duì)，并用DNAman軟件進(jìn)行其氨基酸序列同源性比較分析結(jié)果表明，百子蓮ApSERK1蛋白序列與其他植物的體細(xì)胞受體激酶具有非常高的相似性，與水稻（XP_015649858.1）、小蘭嶼蝴蝶蘭（XP_020586612.1）、鐵皮石斛（NP_020698803.1）、椰子樹（AAV58833.2）和菠蘿（XP_020081964.1）等植物蛋白序列的相似性可達(dá)到90%以上（圖6）。

受體激酶的多序列比對(duì)（陰影部分為完全相同的氨基酸）

2.5 APSERK1的空間表達(dá)分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)百子蓮根、莖、葉片、花葶、花器官、種子等不同器官中ApSERK1基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，百子蓮成熟種子中ApSERK1表達(dá)量最高，分別是小花梗、花瓣、子房、花藥、根、老葉、新葉、花絲、莖和花葶的1.88、2.24、3.06、3.48、3.51、4.40、4.97、5.73、6.58和7.62倍；表明在各器官中，百子蓮成熟種子的胚性能力最強(qiáng)，其次是花器官，最后是根與葉；在花器官中，以小花梗中的ApSERK1表達(dá)量最高，分別是花瓣、子房和花藥的1.19、1.62、1.85倍（圖7）。

進(jìn)一步對(duì)不同濃度毒莠定（PIC）處理下的百子蓮的胚性愈傷組織進(jìn)行了PCR檢測(cè)，分析得出PIC1.0濃度處理的胚性愈傷組織中的ApSERK1表達(dá)量最高，分別是1.5濃度、2.0濃度處理的1.6和4倍，表明隨著外源生長素濃度的增加，胚性愈傷組織的胚性能力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖8）。

3 結(jié)論與討論

從百子蓮中克隆得到SERK同源基因DNA全長序列，并命名為ApSERK1。ApSERK1基因開放閱讀框（ORF）為1800bp，編碼1個(gè)含有600個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，運(yùn)用生物信息學(xué)BLASTx軟件對(duì)ApSERK1進(jìn)行同源性序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，其與水稻、蝴蝶蘭、鐵皮石斛等單子葉植物中已經(jīng)分離的SERK基因有非常高的同源性。目前已經(jīng)在馬尾松[10]、挪威云杉[11，12]、白云杉[13，14]、日本落葉松[15]、墨西哥垂松[16]、火炬松[17]、輻射松[18]、川西云杉[19]等裸子植物和水稻[20]、紫花苜蓿[21-22]、菊苣[23]、香石竹[24]、矮牽牛[25]、唐菖蒲[26]、仙客來[27]、棉花[28]、大豆[28]、龍眼[29]等被子植物上克隆得到了SERK的同源基因。其中很多植物中都已經(jīng)證明SERK受體激酶不僅是胚性能力的體現(xiàn)，同時(shí)參與了油菜素內(nèi)酯代謝與合成途徑，生長素反應(yīng)與油菜素內(nèi)酯反應(yīng)所涉及的基因具有重疊性，通常生長素抑制的基因也能被油菜素內(nèi)酯所抑制，表明兩者的信號(hào)通道有著某種聯(lián)系，而植物想要保持胚性必須運(yùn)用外源的各類生長素進(jìn)行誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)[30]。

通過實(shí)時(shí)熒光定量分析可以看出，ApSERK1基因有一定時(shí)空表達(dá)差異，在百子蓮不同組織器官中都有表達(dá)，在種子、小花梗中表達(dá)含量最高，且隨著外源生長素濃度的增加，胚性愈傷組織的胚性能力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。范現(xiàn)麗在2009年建立了百子蓮的體細(xì)胞培養(yǎng)體系，其中分別用了百子蓮的根、花葶、葉以及各花器官做了誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，無論是在愈傷組織誘導(dǎo)階段還是在胚性愈傷組織誘導(dǎo)階段，百子蓮的小花梗始終是誘導(dǎo)材料的首選[8]。雖然百子蓮的種子是胚性最強(qiáng)的器官，但由于其在上海地區(qū)結(jié)實(shí)率很低[7]，主要依靠國外進(jìn)口，因此百子蓮的小花梗依舊是其誘導(dǎo)體細(xì)胞的最佳選擇。研究中推測(cè)ApSERK1基因也是具有生物功能的SERK類似基因，具體怎樣調(diào)節(jié)百子蓮的體細(xì)胞使其保持胚性，還需要做進(jìn)一步深入研究。

結(jié)合前期研究結(jié)果，百子蓮ApSERK1全長cDNA的成功克隆對(duì)進(jìn)一步探討其表達(dá)調(diào)控特征和分析表達(dá)產(chǎn)物的生化特性提供了理論依據(jù)，為在分子水平上研究百子蓮體細(xì)胞胚性保持與胚性喪失等方面的嘗試奠定了基礎(chǔ)，此研究對(duì)深入探討百子蓮胚性保持機(jī)制，揭示植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑等方面具有重要的意義。

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（責(zé)編：徐世紅）