王蘭英，施姚，張生枝，徐瑛，何燕，朱雪瓊

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027；2.余姚市人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 寧波315400）

宮頸癌是全球婦女中第三常見的惡性腫瘤[1]，宮頸癌前病變的篩查仍是預(yù)防宮頸癌的主要手段。無(wú)明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）和低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesions，LSIL）在宮頸細(xì)胞學(xué)篩查異常結(jié)果中是最常見的。ASCUS及LSIL約占宮頸脫落細(xì)胞學(xué)的10%～20%，而ASCUS和LSIL的CINII+病變率約為15%[2]，因此合理處理ASCUS及LSIL一直是臨床醫(yī)師面臨的實(shí)際問(wèn)題之一。研究表明，E6E7 mRNA檢測(cè)的敏感性和HPV DNA相當(dāng)，而特異性更好[3-4]，因此E6/E7 mRNA成為篩選HPV DNA陽(yáng)性而細(xì)胞學(xué)輕度異常（ASCUS及LSIL）患者的生物標(biāo)志物[5]。本研究主要對(duì)HPV DNA陽(yáng)性，細(xì)胞學(xué)輕度異常（ASCUS或LSIL）且陰道鏡下活檢病理學(xué)結(jié)果為CINII-的患者行E6/E7 mRNA測(cè)定，并分析隨訪2年后CINII+的發(fā)生率，探討對(duì)HPV DNA陽(yáng)性且細(xì)胞學(xué)輕度異常（ASCUS或LSIL）、陰道鏡下活檢病理學(xué)結(jié)果為CINII-患者的合理處理方法。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集余姚市人民醫(yī)院門診2015年1月至2015年12月薄層液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)（thinprep cytologic test，TCT）結(jié)果為ASCUS或LSIL、HPV-DNA高危陽(yáng)性的女性患者332例，年齡30～65歲。排除妊娠、既往因?qū)m頸病變行手術(shù)治療、盆腔放射史、子宮切除病史者。均行HPV E6/E7 mRNA檢查，均在簽署知情同意書后行陰道鏡下活檢及病理學(xué)檢查。

1.2 方法

1.2.1 TCT方法：TCT毛刷取材，取材前應(yīng)禁止性生活及陰道沖洗3 d，取材位置在宮頸管及鱗柱上皮交界處，向同一方向旋轉(zhuǎn)5圈，將細(xì)胞刷洗在TCT專用取樣瓶中，經(jīng)TCT專用制片機(jī)制成薄層涂片，樣本經(jīng)巴氏染色后鏡檢。

1.2.2 HPV DNA檢測(cè)：暴露宮頸后，采用HPV專用毛刷，伸入宮頸口，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5圈，將刷頭折斷保存在HPV專用取樣瓶中。采用PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。HPV毛刷、細(xì)胞保存液、試劑盒及儀器均購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司，試劑批號(hào)為：201507211。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)：利用TCT剩余標(biāo)本檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA。試劑盒和儀器均購(gòu)自鄭州中美合資科蒂亞生物技術(shù)有限公司，試劑批號(hào)為：1501a1。由實(shí)驗(yàn)人員記錄標(biāo)本編號(hào)，事先對(duì)標(biāo)本診斷不知情，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。Quanti-Virus-tm冷光儀檢測(cè)標(biāo)本，檢測(cè)結(jié)果為光子數(shù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查：由護(hù)士登記患者資料后，婦產(chǎn)科陰道鏡?？漆t(yī)師對(duì)患者行陰道鏡下檢查，涂碘液后，對(duì)可疑病灶進(jìn)行定位活檢。標(biāo)本制片由病理科醫(yī)師完成。診斷分為：正?；蜓装Y，宮頸上皮內(nèi)瘤變，浸潤(rùn)癌。

1.2.5 隨訪：病理檢查結(jié)果為CINII-的患者定為隨訪對(duì)象，隨訪間隔為6個(gè)月，隨訪總時(shí)間為24個(gè)月。隨訪方式為TCT檢查、宮頸HPV檢測(cè)、陰道鏡下檢查及宮頸活檢。隨訪期間高危型HPV陽(yáng)性病例在自愿的原則下均接受正規(guī)療程的抗病毒治療，治療藥物均為同一種藥物。隨訪終點(diǎn)為：①陰道鏡下病理活檢為CINII+；②TCT及HPV檢查均轉(zhuǎn)為陰性；③到達(dá)隨訪時(shí)間2年。隨訪期間出現(xiàn)妊娠或因其他原因行子宮切除術(shù)的視為無(wú)效。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。率的比較采用χ2檢驗(yàn)，隨訪資料采用Kaplan-Meier法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

332例高危HPV DNA陽(yáng)性患者中，ASCUS共154例（占46.4%），LSIL共178例（占53.56%），其中E6/E7 mRNA陽(yáng)性204例（占61.4%），陰性128（占38.6%），初次陰道鏡下活檢病理分布情況見表1。E6/E7 mRNA陽(yáng)性組CINII+發(fā)生率為42/204（20.6%），陰性組為13/128（10.2%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.46，P=0.02）。

表1 332例患者初次陰道鏡檢查結(jié)果（例）

陰道鏡下檢查無(wú)可疑病灶及病理結(jié)果為炎性病變及CINI的患者共277例進(jìn)入隨訪，隨訪期間有17例失訪，2例妊娠，1例行子宮切除術(shù)，最終257例（E6/E7 mRNA陽(yáng)性組158例，陰性組99例）患者完成隨訪（24個(gè)月），E6/E7 mRNA陽(yáng)性組共發(fā)生CINII+ 33例（占20.89%），陰性組發(fā)生CINII+ 7例（占7.07%），累積疾病進(jìn)展率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），見圖1。

圖1 全部患者E6/E7 mRNA陽(yáng)性組和陰性組隨訪24個(gè)月的疾病進(jìn)展情況

非絕經(jīng)患者187例，E6/E7 mRNA陽(yáng)性116例，陰性71例，陽(yáng)性組共發(fā)生CINII+ 20例（占17.24%），陰性組共發(fā)生CINII+ 5例（占7.04%），累積疾病進(jìn)展率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013），見圖2。

圖2 非絕經(jīng)患者E6/E7 mRNA陽(yáng)性組和陰性組隨訪24個(gè)月的疾病進(jìn)展情況

絕經(jīng)患者70例，其中E6/E7 mRNA陽(yáng)性42例，陰性28例，陽(yáng)性組共發(fā)生CINII+ 13例（占30.95%），陰性組共發(fā)生CINII+ 2例（占7.14%），累積疾病進(jìn)展率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045），見圖3。

E6/E7 mRNA陰性組隨訪6個(gè)月時(shí)無(wú)CINII+病例出現(xiàn)，陰性預(yù)測(cè)值為100%，12個(gè)月時(shí)出現(xiàn)CINII+病例1例，隨訪結(jié)束共出現(xiàn)7例，2年陰性預(yù)測(cè)值為93.2%。E6/E7 mRNA陽(yáng)性組隨訪6個(gè)月時(shí)有3例CINII+病例發(fā)生，隨訪結(jié)束共有33例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為22.4%；E6/E7 mRNA檢測(cè)預(yù)測(cè)CINII+的特異性是42.4%。見表2。

圖3 絕經(jīng)患者E6/E7 mRNA陽(yáng)性組和陰性組隨訪24個(gè)月的疾病進(jìn)展情況

3 討論

高危型HPV DNA持續(xù)感染是絕大多數(shù)癌前病變和宮頸癌發(fā)生的主要原因。HPV相關(guān)的生物標(biāo)志物E6/E7 mRNA是致癌基因E6/E7表達(dá)的直接產(chǎn)物，是導(dǎo)致宮頸病變開始和進(jìn)展的必要條件，更能體現(xiàn)HPV致癌基因的活動(dòng)程度并預(yù)測(cè)病情[6]。本研究經(jīng)過(guò)2年的隨訪發(fā)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)輕度異常（ASCUS或LSIL）的高危型HPV DNA陽(yáng)性患者中，E6/E7 mRNA陽(yáng)性者發(fā)生CINII+風(fēng)險(xiǎn)顯著高于陰性者，HPV E6/E7 mRNA預(yù)測(cè)CINII+發(fā)生的特異性是42.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為22.4%，陰性預(yù)測(cè)值為93.2%。

絕經(jīng)后由于鱗柱交界上移，TCT及陰道鏡檢查準(zhǔn)確率下降[7]，對(duì)這部分人群進(jìn)行合理的癌前篩查，能有效降低宮頸癌的發(fā)病率。ASCIUTTO等[8]報(bào)道，在絕經(jīng)人群中，E6/E7 mRNA預(yù)測(cè)CINII+的特異性達(dá)到60.2%，可作為分流ASCUS及LSIL的生物標(biāo)志物。本研究也表明，在絕經(jīng)人群中，E6/E7 mRNA陽(yáng)性患者疾病的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)高于陰性組。在絕經(jīng)人群E6/E7 mRNA陰性組隨訪18個(gè)月始出現(xiàn)1例CINII+，故對(duì)于細(xì)胞學(xué)輕度異常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA陽(yáng)性的絕經(jīng)患者，若E6/E7 mRNA陰性，可延長(zhǎng)隨訪間隔時(shí)間，避免頻繁的陰道鏡檢查。

表2 E6/E7 mRNA陽(yáng)性組和陰性組隨訪24個(gè)月CINII+的發(fā)生情況

在過(guò)去的50多年，大多數(shù)國(guó)家采用宮頸細(xì)胞學(xué)為全部適齡女性篩查方案，有效降低了宮頸癌的發(fā)病率[9]。一項(xiàng)薈萃分析表明宮頸ASCUS和LSIL的高危型HPV DNA的感染率分別達(dá)到了43%和76%，而大約91%的HPV陽(yáng)性患者能夠在半年至2年后轉(zhuǎn)陰，71%的患者細(xì)胞學(xué)轉(zhuǎn)至正常[10]。HPV DNA檢查較低的特異性增加了不必要的陰道鏡檢查及醫(yī)療資源的浪費(fèi)。而本研究中HPV E6/E7 mRNA預(yù)測(cè)CINII+的特異性是42.4%，和PERSSON等[11]研究HPV E6/E7 mRNA在預(yù)測(cè)CINII+的特異性為50%相似，而明顯高于JOHANSSON等[12]的5.4%～12.7%。這可能與基線HPV E6/E7mRNA陽(yáng)性率有關(guān)，JOHANSSON等的研究中基線HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率為92.1%，而本研究為61.4%。

隨訪中發(fā)現(xiàn)，E6/E7 mRNA陽(yáng)性患者隨訪6個(gè)月后有3例CINII+病例發(fā)現(xiàn)，而這3例均為HPV16/18陽(yáng)性患者，預(yù)示著細(xì)胞學(xué)輕度異常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA陽(yáng)性患者，當(dāng)E6/E7 mRNA和HPV16/18同時(shí)陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)縮短隨訪時(shí)間，加大陰道鏡檢查的頻率，減少漏診率。而針對(duì)E6/E7 mRNA陰性患者，隨訪6個(gè)月時(shí)并無(wú)CINII+病例發(fā)生，隨訪12個(gè)月出現(xiàn)1例，表明對(duì)于細(xì)胞學(xué)輕度異常（ASCUS或LSIL）的高危HPV DNA陽(yáng)性患者，即使E6/E7 mRNA陰性也應(yīng)隨訪，但可延長(zhǎng)隨訪間隔時(shí)間，減少陰道鏡檢查次數(shù)，這與PERSSON等[11]觀點(diǎn)基本一致。需要指出的是E6/E7 mRNA陰性的患者，隨訪24個(gè)月并無(wú)CINIII+及宮頸癌的發(fā)生，對(duì)CINIII+的陰性預(yù)測(cè)值達(dá)到100%，與JOHANSSON等[12]的結(jié)論是一致的。

隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，E6/E7 mRNA陽(yáng)性患者發(fā)生CINII+的累積風(fēng)險(xiǎn)是增加的，24個(gè)月隨訪結(jié)束時(shí)E6/E7 mRNA陽(yáng)性患者發(fā)生CINII+的病例數(shù)明顯多于前3次隨訪的病例數(shù)。

總之，對(duì)高危型HPV DNA陽(yáng)性、TCT為ASCUS或LSIL的患者隨訪中，無(wú)論其是否絕經(jīng)，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)可作為分流此類患者的有效生物標(biāo)志物。當(dāng)E6/E7 mRNA陽(yáng)性，尤其合并HPV16/18陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)縮短隨訪間隔時(shí)間。隨隨訪時(shí)間延長(zhǎng)，若兩者均持續(xù)陽(yáng)性，應(yīng)加大陰道鏡檢查的頻率，以降低漏診率。E6/E7 mRNA陰性患者也應(yīng)隨訪，但可延長(zhǎng)隨訪間隔時(shí)間，以減少陰道鏡檢查次數(shù)。但由于病例數(shù)及隨訪時(shí)間仍有限，更確切的結(jié)論尚待進(jìn)一步的隨訪觀察。