孫蕾，李偉文，黎媛，藍秀，呂祝慶

（浙江大學麗水醫(yī)院 溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 麗水市中心醫(yī)院 呼吸科，浙江 麗水 323000）

肺癌是高發(fā)病率和病死率的惡性腫瘤，在我國肺癌發(fā)病率高達54/10萬，病死率達46/10萬[1-2]。盡管放化療、靶向藥物治療、免疫治療等治療延長了部分患者的生存時間，但極大部分患者仍難以獲得滿意的臨床效果。研究證實從中藥提取的單體及其衍生物具有顯著的抗腫瘤作用[3-4]。燈盞花素（breviscapine，BVP）是燈盞花主要提取成分，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、改善循環(huán)和神經(jīng)保護等作用。研究證實BVP具有顯著的抗腫瘤作用，包括肝癌、結直腸癌、胃癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤[5-6]。也有研究證實BVP具有抗肺癌的作用[7]，但其機制仍未完全明確。本研究將通過多種方法探索BVP對肺癌A549細胞增殖的影響，并初步研究其可能的分子機制，為臨床應用BVP治療肺癌提供科學根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 肺癌A549細胞購買于上海生命科學細胞庫。BVP購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（純度≥98%），MTT、DMSO、臺盼藍購自美國Sigma公司，β-肌動蛋白、Bcl-2、Bax單克隆抗體購自美國Cell Signal Technology公司；胰島素樣生長因子結合蛋白4（Insulin-like growth factor binding protein-4，IGFBP-4）抗體購自德國R&D Systems公司，IGFBP-4 ELISA試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司，Adv-IGFBP-4-OETMDNA、EGFP和Adv-KDTMEasy RNAi EGFP腺病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，qRT-PCR相關試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌A549細胞培養(yǎng)：使用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)，將A549細胞接種于培養(yǎng)皿后，置入37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細胞生長存活率：調(diào)整A549細胞密度為2×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，過夜，加藥后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入20 μL MTT，37 ℃溫箱孵育2 h后，用DMSO 120 μL終止反應。以調(diào)零孔吸光度（A）值調(diào)零校準，酶標儀在492 nm波長處檢測A值。細胞存活率（%）=（各濃度組A值/對照組A值）×100%。

1.2.3 臺盼藍染色：1×106個A549細胞接種于6孔板，0、25、50和100 μmol/L BVP處理48 h，收集細胞，加入1 mL PBS洗滌3次，細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9∶1混合均勻（終濃度0.04%），3 min內(nèi)鏡像觀察死細胞和活細胞情況。統(tǒng)計死細胞率（%）=死細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）×100%。

1.2.4 細胞凋亡檢測：用1×106個A549細胞接種于6孔板，經(jīng)0、25、50和100 μmol/L BVP處理48 h后，收集細胞，加入1 mL PBS洗滌3次，再加入500 μL Binding buffer，并依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，室溫下避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot檢測：1×106個A549細胞接種于6孔板，加藥48 h后，PBS漂洗2次后，加入細胞裂解液冰上裂解15 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清。經(jīng)BCA法定量后，取20 μg總蛋白4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，3%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃孵育過夜，隨后PBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次8 min，加入HRP標記的二抗室溫孵育1～2 h，再用PBST緩沖液洗PVDF膜3次，每次8 min，ECL試劑發(fā)光、顯影和定影，并用Image J軟件進行分析。

1.2.6 ELISA檢測：1×106個A549細胞接種于6孔板，過夜，加入0、25、50、100 μmol/L BVP加藥處理48 h，用無菌管收集細胞培養(yǎng)基上清，經(jīng)離心20 min（2 000～3 000 r/min），仔細收集上清，按照ELISA試劑盒說明書步驟操作后，設置酶標儀波長為450 nm，并依序測量各孔的吸光度（A）。IGFBP-4相對比值=（實驗組平均A值/對照組平均A值）。

1.2.7 RT-qPCR檢測：加藥處理48 h后，采用TRIZOL法抽提組織總RNA，并按照說明書步驟合成cDNA，接著進行熒光定量PCR，反應體系為25 μL，使用GAPDH作為內(nèi)參照，引物系列如下：IGFBP-4：上游5’-GGGTGTTCTCTTTGGTGTTA-3’，下游5’-TGTTTTTAGGT GGCTGGATG-3’；GAPDH：上游5’-CTCCTCCTGTTCGACA GTCAGC-3’；下游5’-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’；采用ΔΔCt法分析IGFBP-4 mRNA的表達量。

1.2.8 IGFBP-4腺病毒感染：按照說明書，用5×103個A549細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積為100 μL。融合率為40%～50%時進行病毒感染。取10 μL腺病毒原液稀釋到10-7，未加入病毒的細胞孔中加入同樣量的完全培養(yǎng)基作為對照組，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，8～12 h以后觀察細胞狀態(tài)。在感染后12、24、48 h觀察細胞中熒光表達情況，并獲取高表達或者低表達IGFBP-4的A549細胞，并用Western blot進行驗證。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS22.0軟件進行處理，計量資料以表示，采用單因素方差分析進行顯著性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BVP抑制A549細胞存活 與對照組相比，經(jīng)終濃度為25、50和100 μmol/L BVP處理48 h后，MTT結果顯示A549細胞存活率顯著降低，臺盼藍染色示A549細胞死亡比例顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 BVP誘導A549細胞凋亡 流式細胞儀分析結果顯示，與對照組比，25、50和100 μmol/L的BVP處理48 h后，A549細胞的凋亡率均明顯增加，Western blot分析結果顯示Bcl-2蛋白相對表達量降低，而Bax蛋白相對表達量增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 BVP抑制A549細胞存活

圖2 BVP對A549細胞凋亡的影響

2.3 BVP促進A549細胞IGFBP-4表達 Western blot和RT-qPCR檢測結果顯示，與對照組相比，25、50、100 μmol/L BVP處理48 h后，A549細胞IGFBP-4蛋白和mRNA表達量升高，ELISA結果顯示培養(yǎng)基中IGFBP-4的含量顯著增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

2.4 IGFBP-4高表達對BVP誘導A549細胞增殖抑制的影響 NC-OE（空載體）和IGFBP-4-OE（高表達）感染A549細胞后，與NC-OE細胞比，IGFBP-4-OE細胞存活率降低，Bax表達增加，Bcl-2表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)100 μmol/L BVP處理48 h后，與NC-OE細胞相比，IGFBP-4-OE細胞存活率顯著降低，Bax表達增加，Bcl-2表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在IGFBP-4-OE細胞中，BVP處理后，細胞存活率減低，Bax表達增加，Bcl-2表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5 IGFBP-4低表達對BVP誘導A549細胞增殖抑制的影響 NC-KD（空載體）和IGFBP-4-KD（低表達）感染A549細胞后，與NC-KD細胞相比，IGFBP-4-KD細胞存活率增加，Bax表達降低、Bcl-2表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經(jīng)100 μmol/L BVP處理48 h后，與NC-KD細胞相比，IGFBP-4-KD細胞存活率增加，Bax表達降低、Bcl-2表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在IGFBP-4-KD細胞中，經(jīng)BVP處理后，細胞存活率降低，增加Bax表達，Bcl-2表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

圖3 BVP對A549細胞IGFBP-4表達的影響

圖4 IGFBP-4高表達對BVP誘導A549細胞增殖抑制的影響

BVP是一種從燈盞花提取的天然黃酮類混合物，其主要成分包括燈盞花甲素、燈盞花乙素及咖啡?？鼘幩狨ヮ?。BVP具有抗腫瘤作用，WU等[5]研究發(fā)現(xiàn)BVP通過上調(diào)Cyt C、Caspase3、Bax，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2抑制肝癌細胞增殖。KE等[8]研究發(fā)現(xiàn)BVP抑制STAT3/AKT通路降低肝癌細胞遷移、降低腫瘤侵襲能力。GUAN等[9]發(fā)現(xiàn)BVP能夠誘發(fā)前列腺癌DNA損傷，促進細胞凋亡，抑制腫瘤生長。也有研究證實BVP能夠通過上調(diào)miRNA-7抑制肺癌細胞增殖[7]。但BVP的抗肺癌作用及其抗癌機制的相關報道仍十分缺乏。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)BVP能夠顯著降低肺癌A549細胞的增殖和細胞活性，促進細胞凋亡；分子水平上，BVP能夠顯著增加Bax表達，而降低Bcl-2的表達，說明BVP具有抗A549細胞增殖，誘導A549細胞凋亡的作用。

圖5 IGFBP-4低表達對BVP誘導A549細胞增殖抑制的影響

IGFBP-4是由位于17q12-q21.1，長度約2 246 bp基因編碼的237個氨基酸，廣泛分布于全身多個器官，也可分泌到血液。IGFBP-4作為負性調(diào)控因子，與腫瘤生長呈負相關關系[10]。IGFBP-4能夠增加腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡比例，抑制荷瘤形成[11]。然而，在肺癌組織中IGFBP-4呈低表達，被認為可能是肺癌細胞增殖、遷移的重要原因之一[12-13]。近年來有研究證實IGFBP-4抑制肺癌腫瘤微環(huán)境中A549細胞侵襲、遷移能力[14]；但也有研究顯示IGFBP-4與預后不良有關[12]。在本研究中，BVP能夠增加IGFBP-4 mRNA和蛋白的表達，并增加IGFBP-4的分泌。IGFBP-4高表達能夠降低A549細胞存活率，增加Bax、降低Bcl-2的表達，說明IGFBP4具有抑制A549細胞增殖的作用。與NC-OE細胞相比，BVP處理后，IGFBP-4高表達細胞的存活率顯著下降，Bax表達增加、Bcl-2表達降低，說明IGFBP-4參與了BVP誘導A549細胞增殖抑制。與NC-KD細胞相比，IGFBP-4低表達細胞增殖活性增加，Bax表達減低、Bcl-2表達增加，說明敲低IGFBP-4有利于A549細胞增殖。經(jīng)BVP處理后，空載體細胞存活率較IGFBP-4低表達細胞明顯下降，說明敲低IGFBP-4抑制了BVP抗A549增殖作用。然而，在IGFBP-4低表達細胞中，經(jīng)BVP處理后，細胞存活率仍降低，提示BVP可能還通過其他途徑發(fā)揮抗A549細胞增殖作用。

綜上所述，BVP具有抑制A549細胞增殖，誘導細胞凋亡的作用，其機制可能與BVP促進IGFBP-4表達增高有關。