曹巖菁，吳佳麗，李鵬，林萍，馮莉，王琴，任謙，謝曉峰

（杭州市第三人民醫(yī)院 全科醫(yī)學科，浙江 杭州 310009）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由血管因素引起的第二大類型的癡呆，是以行為、運動異常、帕金森病樣步態(tài)障礙、構音障礙和自主神經(jīng)功能障礙以及認知功能障礙為主的一組綜合征。而神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸（glutamic，Glu）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等在認知功能障礙的過程中扮演重要的角色。Glu是存在于哺乳動物體內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其功能主要與突觸的適應性、記憶以及神經(jīng)和膠質(zhì)細胞的死亡有關。以往的研究表明，在AD患者中上述神經(jīng)遞質(zhì)常有明顯的變化[1]，而在VaD中這項研究較少。通過建立全腦缺血狀態(tài)下的VaD的動物模型，檢測其行為學及不同遞質(zhì)的囊泡轉運體[谷氨酸囊泡轉運體（glutamic vesicle transporters，vGluTs）、乙酰膽堿囊泡轉運體（acetylcholine vesicle transporters，vAChT）、γ-氨基丁酸囊泡轉運體（γ-aminobutyric acid vesicle transporters，vGAT）]在大鼠海馬CA1-3區(qū)中的表達，為研究全腦缺血所致的VaD疾病發(fā)生的病理生理機制提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 選取SD大鼠36只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXY（滬）2012-0002。雄性18只，雌性18只，年齡19個月，體質(zhì)量230～270 g。實驗前，大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，室溫控制在25～28 ℃，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替光照，排除有游泳障礙的大鼠。

1.2 分組及造模 將SD大鼠編號，隨機分為正常組、對照組、癡呆組。癡呆組模型的建立：腹腔內(nèi)注射硝普鈉（2.0 mg/kg），鈍性分離雙側頸總動脈（common carotid crtery，CCA）；夾閉雙側CCA 10 min，再通5 min，再夾閉10 min，再通，連續(xù)3次，青霉素預防感染，保溫飼養(yǎng)。對照組：步驟同上，僅分離雙側CCA，不阻斷血流。術后縫合消毒，保溫飼養(yǎng)。正常組：不做處理。于術前8～12 h禁食，不禁水。

1.3 Morris水迷宮實驗 正常組、對照組、癡呆組在術后63～68 d行Morris水迷宮實驗檢測空間學習記憶能力。

1.4 T-迷宮延遲交替實驗 為了檢測大鼠工作記憶能力，水迷宮實驗后3 d，所有大鼠均進行T-迷宮延遲交替實驗。

1.5 Western blot檢測 術后12周大鼠完成所有的行為學測試后，選取每組9只大鼠斷頭取腦，行Western blot檢測。BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度。將PVDF膜置于保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學光敏模式曝光顯影。照片以TIFF格式導出后在ImageJ軟件下分析各條帶光密度。

1.6 免疫組織化學檢測vGluTs、vAChT及vGAT的表達 另取每組3只大鼠，斷頭取腦，冰上分離海馬，行免疫組織化學檢測。顯微鏡下觀察，隨機選擇4個不同的視野（×200），判讀陽性表達強度和陽性率。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料均用表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組Morris水迷宮實驗結果 隨訓練次數(shù)的增加，3組大鼠第1天逃避潛伏期的時間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。第2～第5天，癡呆組大鼠與正常組及對照組相比，逃避潛伏期的時間明顯延長，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A；探索實驗中，與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1B。與其他2組比，癡呆組大鼠在目的象限中游行距離占總游行距離的百分比明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1C。而3組大鼠的游泳速度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 3組Morris水迷宮試驗結果

2.2 3組T-迷宮延遲交替實驗結果 第1天3組大鼠之間延緩交替作業(yè)的正確率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與正常組及對照組相比，第7天癡呆組大鼠延緩交替作業(yè)的正確率下降，錯誤率增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 3組T-迷宮延遲交替實驗結果

2.3 3組vGluTs、vAChT及vGAT Western blot檢測結果 與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠海馬vGluT1、vGluT3和vAChT的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而vGluT2和vGAT的表達，3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 3組大鼠海馬中vGluT1、vGluT2、vGluT3、vAChT和vGAT的蛋白表達量

2.4 3組海馬CA1-3中vGluT1陽性神經(jīng)元的表達水平 與正常及對照組相比，癡呆組大鼠海馬CA1-CA3區(qū)中vGluT1陽性神經(jīng)元的水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。

2.5 3組海馬CA1-3中vGluT3陽性神經(jīng)元的表達水平 與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠海馬CA1-CA3區(qū)中vGluT3陽性神經(jīng)元的數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；且CA1區(qū)下降明顯最明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖5。

2.6 3組海馬CA1-3中vAChT陽性神經(jīng)元的表達水平 與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠海馬CA1-CA3區(qū)中vAChT陽性神經(jīng)元的表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；且CA1區(qū)下降最明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖6。

3 討論

Glu經(jīng)vGluTs攝取后，貯存于相應突觸的囊泡內(nèi)[2]。而GABA則是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，除了能夠調(diào)節(jié)記憶和睡眠覺醒的周期外，還可以調(diào)節(jié)因神經(jīng)功能紊亂引起的GABA突觸效能的變化。ACh是另一種與學習記憶關系最為密切的神經(jīng)遞質(zhì)，通常情況下，vAChT能夠特異地定位在膽堿能神經(jīng)突觸囊泡膜上，快速專一的轉運ACh神經(jīng)遞質(zhì)進人囊泡，維持正常ACh神經(jīng)元發(fā)揮作用，因此，vAChT也被看做是特異性較高的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)標志物[3-4]。

Morris水迷宮是評價嚙齒動物空間學習記憶的最常用模型之一[5]。通過讓動物不斷地練習，動物可以充分利用環(huán)境中所提供的標記物與隱匿的平臺之間的關系，再次判斷水中平臺的位置，最終在動物腦內(nèi)形成穩(wěn)定的空間認知。Morris水迷宮實驗結果發(fā)現(xiàn)，癡呆組大鼠與正常及對照組相比，其逃避潛伏期的時間明顯延長。在空間探索實驗中：與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少，且在象限中游行距離占總游行距離的百分比也明顯縮短。除此之外T迷宮實驗中，與正常組及對照組相比，第7天癡呆組大鼠延緩交替作業(yè)的正確率明顯下降，錯誤率明顯增加，提示在慢性全腦缺血狀態(tài)下，癡呆組大鼠存在著多種學習和記憶能力的缺損。

圖4 3組海馬CA1-3區(qū)vGluT1陽性神經(jīng)元表達水平（免疫組織化學染色，×200）

通過間斷對大鼠雙側頸總動脈進行閉塞（BCCAO），成功地建立了VaD的動物模型。以往的研究表明，BCCAO易導致動物腦區(qū)發(fā)生低灌注，從而導致腦代謝變化、學習及記憶功能障礙、神經(jīng)信號傳導障礙等[6]。除此之外，BCCAO導致的慢性腦低灌注還可引起更加嚴重的氧化應激和膽堿能功能的障礙[7]。研究表明，ACh是一種具有多種功能的神經(jīng)遞質(zhì)的有機分子，在記憶形成的過程中扮演極其重要的作用，且在膽堿能神經(jīng)元的胞質(zhì)及神經(jīng)末梢中廣泛存在。通常，其通過ChAT合成，然后由vAChT轉運到突觸小泡中儲存[3]。中樞膽堿能的缺乏會導致AD患者的學習和記憶障礙[8]；然而，關于上述的這些變化的機制如何目前仍然存在爭議。以往的研究表明，Glu在突觸囊泡中的聚集需要vGluT1、vGluT2和vGluT3的共同作用[9]，因此vGluTs常被看作Glu轉運的關鍵性功能標志物[10]。不僅如此，Glu還可以與其他經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)一起釋放產(chǎn)生協(xié)同作用，如膽堿能脊髓運動神經(jīng)元釋放的Glu能夠和興奮其他運動神經(jīng)元[11]。然而，關于興奮性Glu和抑制性GABA神經(jīng)遞質(zhì)的共釋放的學說卻一直備受爭議[12]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性全腦缺血3個月后，癡呆組大鼠海馬vGluT1和vGluT3水平表達明顯降低。而vGluT2和vGAT的水平與正常組及對照組相比卻無明顯變化。除此之外，vAChT神經(jīng)元的數(shù)量在VaD大鼠海馬中的表達也明顯下降。這與慢性腦灌注不足可能引起的BCCAO/AD大鼠海馬中樞膽堿能功能障礙的研究結果[1]一致。在腦內(nèi)，錐體細胞表達vGluT1并組成了哺乳動物大腦皮層70%的神經(jīng)元，而海馬vGluT1神經(jīng)元數(shù)量的明顯下降也從另一個層面反應了大腦皮層Glu能神經(jīng)末端的嚴重受損，即Glu能系統(tǒng)的嚴重損壞。而這種損害大大降低了Glu能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞強度，損壞的區(qū)域同別的皮層及皮層下的區(qū)域產(chǎn)生斷連，于是大鼠的認知功能產(chǎn)生了障礙。本研究還發(fā)現(xiàn)，癡呆組大鼠vAChT和vGluT3神經(jīng)元的數(shù)量在海馬及其亞區(qū)中同步下降，這與vGluT3與膽堿能紋狀體中間神經(jīng)元之間的解剖有關，缺乏vGluT3在一定程度上會導致紋狀體ACh的釋放能力降低[13]。換句話說，囊泡ACh的攝取和釋放是需要Glu的共同協(xié)同作用的，因此當慢性缺血導致海馬中的vGluT3的水平下降時，這種協(xié)同作用也會降低，于是紋狀體ACh的釋放功能也隨之下降。

圖5 3組大鼠海馬CA1-3區(qū)vGluT3陽性神經(jīng)元表達水平（免疫組織化學染色，×200）

海馬是支持和產(chǎn)生記憶功能的網(wǎng)絡中心。在神經(jīng)病理事件如缺血中，海馬是受其影響最大、最脆弱的腦區(qū)之一[14]。通常海馬主要是由齒狀回（DG）和Ammon角（cornu ammonis，CA）組成，且分為4個字段：即CA1、CA2、CA3和CA4[15]。以往的研究表明，CA1和CA2的神經(jīng)元的體積在血管性癡呆、AD和混合性癡呆的患者中明顯減少。而神經(jīng)元體積的減少是導致海馬網(wǎng)絡功能紊亂，認知功能障礙產(chǎn)生的原因之一。同樣，CA3和CA4神經(jīng)元中的錐體神經(jīng)元也會產(chǎn)生類似于CA1和CA2的病理性損傷，因為它們都有著在相似的解剖結構[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在慢性全腦缺血致認知功能障礙的狀態(tài)下，大鼠海馬CA1-3亞區(qū)中vGluT1和vGluT3的陽性神經(jīng)元的數(shù)目明顯降低，且CA1區(qū)較CA2，CA3區(qū)下降更加明顯。同樣，大鼠vAChT陽性神經(jīng)元的數(shù)量在海馬CA1-3亞區(qū)中表達也有明顯降低。原因可能是隨著腦缺血、缺氧或毒性、炎癥反應程度的加重，海馬各亞區(qū)神經(jīng)元細胞逐漸發(fā)生壞死，不同海馬亞區(qū)解剖及血管機制的差異使得CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量較CA2及CA3亞區(qū)[14]明顯降低，于是大鼠腦內(nèi)信息流輸入及輸出出現(xiàn)偏差，近期記憶形成障礙，儲存和提取功能缺損，最終出現(xiàn)認知功能障礙。通常認知功能的啟動和維持不僅需要各腦區(qū)和神經(jīng)核團的共同參與，還需要全腦神經(jīng)的網(wǎng)絡對所獲信息進行全面處理、加工和整合，神經(jīng)元之間，各腦區(qū)神經(jīng)回路之間及神經(jīng)網(wǎng)絡之間的正常聯(lián)系也是記憶產(chǎn)生的必要條件，而這些聯(lián)系的產(chǎn)生通常依賴于突觸的存在和完整性。突觸一旦丟失，尤其是廣泛丟失，信息就將無法進行傳遞，正常的記憶也隨之丟失，于是出現(xiàn)認知功能障礙，且隨著大腦缺血時間的延長，癥狀逐漸加重。

圖6 3組大鼠海馬CA1-3區(qū)中vAChT陽性神經(jīng)元表達水平（免疫組織化學染色，×200）

谷氨酸膽堿能囊泡裝運體功能的缺陷，谷氨酸中樞膽堿能遞質(zhì)之間的不平衡，海馬CA1、CA2以及CA3信息環(huán)路的損壞是慢性全腦缺血大鼠認知功能障礙產(chǎn)生的主要原因。