曹巖菁，吳佳麗，李鵬，林萍，馮莉，王琴，任謙，謝曉峰

（杭州市第三人民醫(yī)院 全科醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州 310009）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由血管因素引起的第二大類型的癡呆，是以行為、運(yùn)動(dòng)異常、帕金森病樣步態(tài)障礙、構(gòu)音障礙和自主神經(jīng)功能障礙以及認(rèn)知功能障礙為主的一組綜合征。而神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸（glutamic，Glu）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等在認(rèn)知功能障礙的過程中扮演重要的角色。Glu是存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，其功能主要與突觸的適應(yīng)性、記憶以及神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞的死亡有關(guān)。以往的研究表明，在AD患者中上述神經(jīng)遞質(zhì)常有明顯的變化[1]，而在VaD中這項(xiàng)研究較少。通過建立全腦缺血狀態(tài)下的VaD的動(dòng)物模型，檢測其行為學(xué)及不同遞質(zhì)的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體[谷氨酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體（glutamic vesicle transporters，vGluTs）、乙酰膽堿囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體（acetylcholine vesicle transporters，vAChT）、γ-氨基丁酸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)體（γ-aminobutyric acid vesicle transporters，vGAT）]在大鼠海馬CA1-3區(qū)中的表達(dá)，為研究全腦缺血所致的VaD疾病發(fā)生的病理生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 選取SD大鼠36只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號：SCXY（滬）2012-0002。雄性18只，雌性18只，年齡19個(gè)月，體質(zhì)量230～270 g。實(shí)驗(yàn)前，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，室溫控制在25～28 ℃，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替光照，排除有游泳障礙的大鼠。

1.2 分組及造模 將SD大鼠編號，隨機(jī)分為正常組、對照組、癡呆組。癡呆組模型的建立：腹腔內(nèi)注射硝普鈉（2.0 mg/kg），鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid crtery，CCA）；夾閉雙側(cè)CCA 10 min，再通5 min，再夾閉10 min，再通，連續(xù)3次，青霉素預(yù)防感染，保溫飼養(yǎng)。對照組：步驟同上，僅分離雙側(cè)CCA，不阻斷血流。術(shù)后縫合消毒，保溫飼養(yǎng)。正常組：不做處理。于術(shù)前8～12 h禁食，不禁水。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 正常組、對照組、癡呆組在術(shù)后63～68 d行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測空間學(xué)習(xí)記憶能力。

1.4 T-迷宮延遲交替實(shí)驗(yàn) 為了檢測大鼠工作記憶能力，水迷宮實(shí)驗(yàn)后3 d，所有大鼠均進(jìn)行T-迷宮延遲交替實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot檢測 術(shù)后12周大鼠完成所有的行為學(xué)測試后，選取每組9只大鼠斷頭取腦，行Western blot檢測。BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。將PVDF膜置于保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。照片以TIFF格式導(dǎo)出后在ImageJ軟件下分析各條帶光密度。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測vGluTs、vAChT及vGAT的表達(dá) 另取每組3只大鼠，斷頭取腦，冰上分離海馬，行免疫組織化學(xué)檢測。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇4個(gè)不同的視野（×200），判讀陽性表達(dá)強(qiáng)度和陽性率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均用表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，3組大鼠第1天逃避潛伏期的時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第2～第5天，癡呆組大鼠與正常組及對照組相比，逃避潛伏期的時(shí)間明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A；探索實(shí)驗(yàn)中，與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1B。與其他2組比，癡呆組大鼠在目的象限中游行距離占總游行距離的百分比明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1C。而3組大鼠的游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 3組Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

2.2 3組T-迷宮延遲交替實(shí)驗(yàn)結(jié)果 第1天3組大鼠之間延緩交替作業(yè)的正確率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常組及對照組相比，第7天癡呆組大鼠延緩交替作業(yè)的正確率下降，錯(cuò)誤率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 3組T-迷宮延遲交替實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 3組vGluTs、vAChT及vGAT Western blot檢測結(jié)果 與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠海馬vGluT1、vGluT3和vAChT的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而vGluT2和vGAT的表達(dá)，3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 3組大鼠海馬中vGluT1、vGluT2、vGluT3、vAChT和vGAT的蛋白表達(dá)量

2.4 3組海馬CA1-3中vGluT1陽性神經(jīng)元的表達(dá)水平 與正常及對照組相比，癡呆組大鼠海馬CA1-CA3區(qū)中vGluT1陽性神經(jīng)元的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

2.5 3組海馬CA1-3中vGluT3陽性神經(jīng)元的表達(dá)水平 與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠海馬CA1-CA3區(qū)中vGluT3陽性神經(jīng)元的數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且CA1區(qū)下降明顯最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。

2.6 3組海馬CA1-3中vAChT陽性神經(jīng)元的表達(dá)水平 與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠海馬CA1-CA3區(qū)中vAChT陽性神經(jīng)元的表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；且CA1區(qū)下降最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖6。

3 討論

Glu經(jīng)vGluTs攝取后，貯存于相應(yīng)突觸的囊泡內(nèi)[2]。而GABA則是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，除了能夠調(diào)節(jié)記憶和睡眠覺醒的周期外，還可以調(diào)節(jié)因神經(jīng)功能紊亂引起的GABA突觸效能的變化。ACh是另一種與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的神經(jīng)遞質(zhì)，通常情況下，vAChT能夠特異地定位在膽堿能神經(jīng)突觸囊泡膜上，快速專一的轉(zhuǎn)運(yùn)ACh神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)人囊泡，維持正常ACh神經(jīng)元發(fā)揮作用，因此，vAChT也被看做是特異性較高的膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)標(biāo)志物[3-4]。

Morris水迷宮是評價(jià)嚙齒動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的最常用模型之一[5]。通過讓動(dòng)物不斷地練習(xí)，動(dòng)物可以充分利用環(huán)境中所提供的標(biāo)記物與隱匿的平臺之間的關(guān)系，再次判斷水中平臺的位置，最終在動(dòng)物腦內(nèi)形成穩(wěn)定的空間認(rèn)知。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癡呆組大鼠與正常及對照組相比，其逃避潛伏期的時(shí)間明顯延長。在空間探索實(shí)驗(yàn)中：與正常組及對照組相比，癡呆組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少，且在象限中游行距離占總游行距離的百分比也明顯縮短。除此之外T迷宮實(shí)驗(yàn)中，與正常組及對照組相比，第7天癡呆組大鼠延緩交替作業(yè)的正確率明顯下降，錯(cuò)誤率明顯增加，提示在慢性全腦缺血狀態(tài)下，癡呆組大鼠存在著多種學(xué)習(xí)和記憶能力的缺損。

圖4 3組海馬CA1-3區(qū)vGluT1陽性神經(jīng)元表達(dá)水平（免疫組織化學(xué)染色，×200）

通過間斷對大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行閉塞（BCCAO），成功地建立了VaD的動(dòng)物模型。以往的研究表明，BCCAO易導(dǎo)致動(dòng)物腦區(qū)發(fā)生低灌注，從而導(dǎo)致腦代謝變化、學(xué)習(xí)及記憶功能障礙、神經(jīng)信號傳導(dǎo)障礙等[6]。除此之外，BCCAO導(dǎo)致的慢性腦低灌注還可引起更加嚴(yán)重的氧化應(yīng)激和膽堿能功能的障礙[7]。研究表明，ACh是一種具有多種功能的神經(jīng)遞質(zhì)的有機(jī)分子，在記憶形成的過程中扮演極其重要的作用，且在膽堿能神經(jīng)元的胞質(zhì)及神經(jīng)末梢中廣泛存在。通常，其通過ChAT合成，然后由vAChT轉(zhuǎn)運(yùn)到突觸小泡中儲(chǔ)存[3]。中樞膽堿能的缺乏會(huì)導(dǎo)致AD患者的學(xué)習(xí)和記憶障礙[8]；然而，關(guān)于上述的這些變化的機(jī)制如何目前仍然存在爭議。以往的研究表明，Glu在突觸囊泡中的聚集需要vGluT1、vGluT2和vGluT3的共同作用[9]，因此vGluTs常被看作Glu轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵性功能標(biāo)志物[10]。不僅如此，Glu還可以與其他經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)一起釋放產(chǎn)生協(xié)同作用，如膽堿能脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元釋放的Glu能夠和興奮其他運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元[11]。然而，關(guān)于興奮性Glu和抑制性GABA神經(jīng)遞質(zhì)的共釋放的學(xué)說卻一直備受爭議[12]。本研究發(fā)現(xiàn)慢性全腦缺血3個(gè)月后，癡呆組大鼠海馬vGluT1和vGluT3水平表達(dá)明顯降低。而vGluT2和vGAT的水平與正常組及對照組相比卻無明顯變化。除此之外，vAChT神經(jīng)元的數(shù)量在VaD大鼠海馬中的表達(dá)也明顯下降。這與慢性腦灌注不足可能引起的BCCAO/AD大鼠海馬中樞膽堿能功能障礙的研究結(jié)果[1]一致。在腦內(nèi)，錐體細(xì)胞表達(dá)vGluT1并組成了哺乳動(dòng)物大腦皮層70%的神經(jīng)元，而海馬vGluT1神經(jīng)元數(shù)量的明顯下降也從另一個(gè)層面反應(yīng)了大腦皮層Glu能神經(jīng)末端的嚴(yán)重受損，即Glu能系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p壞。而這種損害大大降低了Glu能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞強(qiáng)度，損壞的區(qū)域同別的皮層及皮層下的區(qū)域產(chǎn)生斷連，于是大鼠的認(rèn)知功能產(chǎn)生了障礙。本研究還發(fā)現(xiàn)，癡呆組大鼠vAChT和vGluT3神經(jīng)元的數(shù)量在海馬及其亞區(qū)中同步下降，這與vGluT3與膽堿能紋狀體中間神經(jīng)元之間的解剖有關(guān)，缺乏vGluT3在一定程度上會(huì)導(dǎo)致紋狀體ACh的釋放能力降低[13]。換句話說，囊泡ACh的攝取和釋放是需要Glu的共同協(xié)同作用的，因此當(dāng)慢性缺血導(dǎo)致海馬中的vGluT3的水平下降時(shí)，這種協(xié)同作用也會(huì)降低，于是紋狀體ACh的釋放功能也隨之下降。

圖5 3組大鼠海馬CA1-3區(qū)vGluT3陽性神經(jīng)元表達(dá)水平（免疫組織化學(xué)染色，×200）

海馬是支持和產(chǎn)生記憶功能的網(wǎng)絡(luò)中心。在神經(jīng)病理事件如缺血中，海馬是受其影響最大、最脆弱的腦區(qū)之一[14]。通常海馬主要是由齒狀回（DG）和Ammon角（cornu ammonis，CA）組成，且分為4個(gè)字段：即CA1、CA2、CA3和CA4[15]。以往的研究表明，CA1和CA2的神經(jīng)元的體積在血管性癡呆、AD和混合性癡呆的患者中明顯減少。而神經(jīng)元體積的減少是導(dǎo)致海馬網(wǎng)絡(luò)功能紊亂，認(rèn)知功能障礙產(chǎn)生的原因之一。同樣，CA3和CA4神經(jīng)元中的錐體神經(jīng)元也會(huì)產(chǎn)生類似于CA1和CA2的病理性損傷，因?yàn)樗鼈兌加兄谙嗨频慕馄式Y(jié)構(gòu)[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在慢性全腦缺血致認(rèn)知功能障礙的狀態(tài)下，大鼠海馬CA1-3亞區(qū)中vGluT1和vGluT3的陽性神經(jīng)元的數(shù)目明顯降低，且CA1區(qū)較CA2，CA3區(qū)下降更加明顯。同樣，大鼠vAChT陽性神經(jīng)元的數(shù)量在海馬CA1-3亞區(qū)中表達(dá)也有明顯降低。原因可能是隨著腦缺血、缺氧或毒性、炎癥反應(yīng)程度的加重，海馬各亞區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞逐漸發(fā)生壞死，不同海馬亞區(qū)解剖及血管機(jī)制的差異使得CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)量較CA2及CA3亞區(qū)[14]明顯降低，于是大鼠腦內(nèi)信息流輸入及輸出出現(xiàn)偏差，近期記憶形成障礙，儲(chǔ)存和提取功能缺損，最終出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。通常認(rèn)知功能的啟動(dòng)和維持不僅需要各腦區(qū)和神經(jīng)核團(tuán)的共同參與，還需要全腦神經(jīng)的網(wǎng)絡(luò)對所獲信息進(jìn)行全面處理、加工和整合，神經(jīng)元之間，各腦區(qū)神經(jīng)回路之間及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之間的正常聯(lián)系也是記憶產(chǎn)生的必要條件，而這些聯(lián)系的產(chǎn)生通常依賴于突觸的存在和完整性。突觸一旦丟失，尤其是廣泛丟失，信息就將無法進(jìn)行傳遞，正常的記憶也隨之丟失，于是出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，且隨著大腦缺血時(shí)間的延長，癥狀逐漸加重。

圖6 3組大鼠海馬CA1-3區(qū)中vAChT陽性神經(jīng)元表達(dá)水平（免疫組織化學(xué)染色，×200）

谷氨酸膽堿能囊泡裝運(yùn)體功能的缺陷，谷氨酸中樞膽堿能遞質(zhì)之間的不平衡，海馬CA1、CA2以及CA3信息環(huán)路的損壞是慢性全腦缺血大鼠認(rèn)知功能障礙產(chǎn)生的主要原因。