涂夢(mèng)蕓，王志翊，萬(wàn)新龍，翁杰，謝夢(mèng)影，鄭曉群

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 全科醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)科大學(xué) 健康與環(huán)境生態(tài)研究所，浙江 溫州 325035；5.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 呼吸科，浙江 溫州 325015）

胺碘酮是一種含碘苯丙呋喃衍生物，作為III類(lèi)抗心律失常藥物廣泛應(yīng)用于臨床[1]。然而，胺碘酮的使用受到其不良反應(yīng)的限制[2]。大多數(shù)不良反應(yīng)都是小且可逆的，最嚴(yán)重的毒性是潛在致命的胺碘酮誘導(dǎo)的肺部毒性（amiodarone-induced pulmonary toxicity，AIPT）。這種不良反應(yīng)通常與長(zhǎng)期使用胺碘酮相關(guān)，高達(dá)5%～13%的患者以劑量依賴(lài)的方式發(fā)生，并導(dǎo)致10%～23%的患者死亡[3]。AIPT的病因尚未完全了解，其可能的機(jī)制包括直接細(xì)胞損傷、磷脂沉積、氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)釋放等[4]。目前，尋找有效的藥物治療AIPT、阻止胺碘酮對(duì)肺的毒性作用是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。研究[5-6]表明，三七皂苷R1是中藥三七的主要活性成分，具有活血化瘀、抗氧化、抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流等作用，但其是否具有對(duì)抗胺碘酮致細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用胺碘酮在體外建立人胚肺成纖維細(xì)胞（human embryonic lung fibroblast，HELFs）氧化應(yīng)激損傷模型，探討不同濃度的三七皂苷R1對(duì)該氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑：胺碘酮購(gòu)自法國(guó)賽諾菲-圣德拉堡民生制藥有限公司。三七皂苷R1購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。HELFs購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物公司。

1.1.2 儀器：酶標(biāo)儀、HEPA CO2恒溫培養(yǎng)箱、1300 SERIES A2生物安全柜均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組：使用含10% FBS、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)HELFs，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡每日觀察HELFs狀態(tài)并按時(shí)換液。2 d進(jìn)行一次傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[7]。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、胺碘酮組、三七皂苷R1干預(yù)組和三七皂苷R1對(duì)照組。對(duì)照組為單純細(xì)胞培養(yǎng)；胺碘酮組為在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入6 μg/mL胺碘酮；三七皂苷R1干預(yù)組為在胺碘酮組基礎(chǔ)上，分別加入三七皂苷R1（25、50、100 μg/mL）干預(yù)；三七皂苷R1對(duì)照組為在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入100 μg/mL三七皂苷R1。以上各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，觀察各組細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA和SOD水平的改變。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察與細(xì)胞增殖檢測(cè)：采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，用CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。HELFs以1×104/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)平行孔。按照1.2.1分組方法進(jìn)行分組，藥物作用24 h后，吸去培養(yǎng)液，各孔加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基100 μL和CCK8試劑10 μL，同時(shí)設(shè)置不含細(xì)胞的空白對(duì)照組，在避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，通過(guò)酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定各孔吸光度。

1.2.3 ROS含量檢測(cè)：按照1∶1 000的比例用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。稀釋好的探針DCFH-DA加入各組細(xì)胞中，37 ℃避光孵育20 min。用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，使用熒光顯微鏡拍攝熒光圖片，并使用熒光酶標(biāo)儀，在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.2.4 酶化學(xué)法測(cè)定SOD和MDA水平：細(xì)胞分組處理完畢后，胰酶消化并收集細(xì)胞，用冷PBS清洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞懸浮于500 μL PBS中，超聲波裂解細(xì)胞，4 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)SOD活性和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)變化 對(duì)照組細(xì)胞呈較寬大的紡錘形，胺碘酮組細(xì)胞明顯變細(xì)變長(zhǎng)，呈扁平狹長(zhǎng)的梭形，三七皂苷R1干預(yù)組及三七皂苷R1對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)和對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)相似，見(jiàn)圖1。

2.2 各組細(xì)胞的增殖活性 與對(duì)照組相比，胺碘酮組OD值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與胺碘酮組相比，25、50、100 μg/mL三七皂苷R1干預(yù)組OD值下降，其中100 μg/mL三七皂苷R1干預(yù)組下降最明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三七皂苷R1對(duì)照組與對(duì)照組相比，OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.3 各組細(xì)胞的ROS水平 熒光顯微鏡結(jié)果示，胺碘酮組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與胺碘酮組相比，25 μg/mL三七皂苷R1干預(yù)后熒光強(qiáng)度無(wú)明顯改變，而50、100 μg/mL三七皂苷R1干預(yù)后ROS熒光強(qiáng)度明顯下降，見(jiàn)圖2。熒光酶標(biāo)儀結(jié)果示，與對(duì)照組相比，胺碘酮組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；50、100 μg/mL三七皂苷R1干預(yù)后可以使ROS熒光強(qiáng)度下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三七皂苷R1對(duì)照組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×200）

表1 各組細(xì)胞增殖活性比較（每組n=3，

表1 各組細(xì)胞增殖活性比較（每組n=3，

與對(duì)照組比：aP＜0.01；與胺碘酮組比：bP＜0.05

組別 OD值對(duì)照組 0.77±0.10胺碘酮組 1.35±0.04a三七皂苷R1（25 μg/mL）干預(yù)組 1.03±0.04b三七皂苷R1（50 μg/mL）干預(yù)組 0.95±0.08b三七皂苷R1（100 μg/mL）干預(yù)組 0.85±0.08b三七皂苷R1對(duì)照組 0.79±0.05

2.4 各組細(xì)胞的MDA含量、SOD活性 與對(duì)照組相比，胺碘酮作用后HELFs中MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SOD生成顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與胺碘酮組相比，50、100 μg/mL三七皂苷R1干預(yù)后能顯著調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶表達(dá)，其中MDA濃度降低，而SOD活性增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三七皂苷R1對(duì)照組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

長(zhǎng)期使用胺碘酮會(huì)導(dǎo)致一些不良反應(yīng)的發(fā)生，其中AIPT可能發(fā)展成不可逆轉(zhuǎn)的肺纖維化因而引起人們廣泛關(guān)注[8-9]。動(dòng)物研究表明，肺中氧化應(yīng)激的增強(qiáng)是AIPT發(fā)展過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，且使用抗氧化劑可以減緩AIPT的進(jìn)程[10]。三七總皂苷是中藥三七的主要有效成分，而三七皂苷R1是三七總皂苷的主要活性單位。三七皂苷R1主要作用包括減輕炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激和防治缺血再灌注損傷[11-12]。

圖2 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞ROS水平（×200）

表2 各組細(xì)胞ROS水平比較（每組n=3，

表2 各組細(xì)胞ROS水平比較（每組n=3，

與對(duì)照組比：aP＜0.01；與胺碘酮組比：bP＜0.05

組別 熒光強(qiáng)度對(duì)照組 3 691±309胺碘酮組 6 320±528a三七皂苷R1（25 μg/mL）干預(yù)組 5 982±360三七皂苷R1（50 μg/mL）干預(yù)組 4 498±407b三七皂苷R1（100 μg/mL）干預(yù)組 4 293±366b三七皂苷R1對(duì)照組 3 413±453

表3 各組細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量比較（每組n=3，

表3 各組細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量比較（每組n=3，

與對(duì)照組比：aP＜0.01；與胺碘酮組比：bP＜0.05

組別 SOD（U/mg prot）MDA（nmoL/mg prot）對(duì)照組 24.31±1.67 1.35±0.17胺碘酮組 13.51±1.26a 3.82±0.36a三七皂苷R1（25 μg/mL）干預(yù)組 16.94±0.91 3.00±0.27三七皂苷R1（50 μg/mL）干預(yù)組 19.93±1.11b 2.60±0.19b三七皂苷R1（100 μg/mL）干預(yù)組 21.76±1.47b 2.05±0.26b三七皂苷R1對(duì)照組 21.77±1.49 1.14±0.10

AIPT的主要病理學(xué)改變表現(xiàn)為早期彌漫性肺泡炎和后期成纖維細(xì)胞的病理性增殖[13]。本研究采用CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，胺碘酮作用后，HELF細(xì)胞增殖活性明顯升高，表明胺碘酮能夠促進(jìn)HELF細(xì)胞增殖。而在三七皂苷R1干預(yù)后，HELF細(xì)胞的增殖活性顯著降低，且具有濃度依賴(lài)性。三七皂苷R1對(duì)照組和對(duì)照組細(xì)胞的增殖活性不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明三七皂苷R1本身對(duì)HELFs的增殖活性沒(méi)有影響。以上結(jié)果提示三七皂苷R1可能通過(guò)抑制HELFs的增殖從而延緩AIPT的進(jìn)展。

氧化應(yīng)激與肺纖維化的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，在肺纖維化的形成和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)抗氧化治療能減輕肺纖維化的程度[14-15]。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)產(chǎn)生的ROS超出抗氧化劑清除能力時(shí)，細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)趨向氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能發(fā)生障礙[16]。本研究結(jié)果表明胺碘酮作用后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著上升，而在50、100 μg/mL三七皂苷R1干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降。這表明三七皂苷R1一定程度上能夠清除氧自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。脂代謝異?？赡軈⑴c肺纖維化疾病的發(fā)病過(guò)程[17]。有研究報(bào)道，胺碘酮作用于細(xì)胞后所產(chǎn)生的氧自由基能夠攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[18]。MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度和膜系統(tǒng)受損程度。SOD是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，能清除生物體在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，其活性可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。本研究結(jié)果表明，胺碘酮作用于HELFs后，勻漿液中SOD活性明顯下降，而MDA含量明顯升高，這提示胺碘酮能夠引起HELFs氧化損傷。而三七皂苷R1干預(yù)后SOD活性升高，MDA含量降低，這提示三七皂苷R1干預(yù)后HELFs的抗氧化能力增強(qiáng)、脂質(zhì)過(guò)氧化作用減弱，從而減輕胺碘酮誘導(dǎo)的HELFs損傷。

本研究結(jié)果顯示，胺碘酮能夠誘導(dǎo)HELFs增殖能力增強(qiáng)，并發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷?？寡趸瘎┑膽?yīng)用可以減輕胺碘酮引起的HELFs氧化應(yīng)激反應(yīng)[19-20]。在本研究中，三七皂苷R1能明顯減輕胺碘酮誘導(dǎo)的HELFs氧化損傷，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶的表達(dá)，這為臨床上治療AIPT提供理論基礎(chǔ)，而這一作用的具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。