薛 楊， 魏莉娟， 徐 航

1.資陽市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 資陽 641300； 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科

膽囊癌發(fā)生于膽囊體部、頸部及底部，并且以膽囊管侵犯為特征，是一種惡性腫瘤，在我國，膽囊癌在西北和東北部的發(fā)病率最高，在消化道惡性腫瘤中排名第6位，且膽囊癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。膽囊癌易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多基因經(jīng)過多階段共同作用產(chǎn)生的，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型等有關(guān)[2-3]。WWOX是一種抑癌基因，含有脆性位點(diǎn)，其編碼的蛋白可以調(diào)控癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移等過程[4]。在卵巢癌、肺癌、胃癌等組織中均發(fā)現(xiàn)了WWOX基因的表達(dá)下調(diào)甚至缺失[5-7]。本研究以膽囊癌細(xì)胞為研究對象，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法過表達(dá)細(xì)胞中WWOX，探討WWOX對膽囊癌細(xì)胞生長、侵襲、遷移的影響，以期為研究膽囊癌的發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1材料膽囊癌細(xì)胞株GBC購自中科院上海細(xì)胞庫；過表達(dá)WWOX的真核表達(dá)載體(pcDNA3.1-WWOX)由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；WWOX引物由生工生物工程上海(股份)有限公司合成；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(美國Thermo公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒、RNA提取試劑盒(北京TIANGEN公司)；WWOX一抗(美國Cell Signaling公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease 2，MMP-2)一抗、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease 9，MMP-9)一抗(美國Stanta Cruz公司)；波形蛋白(Vimentin)一抗、上皮鈣黏附素(E-cadherin)一抗(美國R&D Systems公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染GBC細(xì)胞用含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2培養(yǎng)箱。細(xì)胞培養(yǎng)至密度超過80%，用含質(zhì)量濃度為25 g/L的胰蛋白酶消化傳代。GBC細(xì)胞分為Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX轉(zhuǎn)染至GBC細(xì)胞中，步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。

1.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中WWOX水平Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72 h，加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)將細(xì)胞洗滌3次，在細(xì)胞中加入含質(zhì)量濃度為25 g/L的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞沉淀，按照106ml-1的Trizol，將細(xì)胞裂解后，放在室溫條件下孵育10 min，按照每1 ml的Trizol加入200 μl的氯仿，劇烈震蕩15 s，放置于室溫條件下靜置3 min。4 ℃，12 000 r/min離心10 min，此時(shí)溶液分為3層，取最上層的溶液轉(zhuǎn)移到EP管中，加入500 μl的異丙醇，在-20 ℃孵育10 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，將上清液吸除后，加入1 ml 75%的乙醇洗滌3次，置于室溫條件下干燥，用20 μl的無Rnase 的雙蒸水溶解。取2 μl的RNA用微量核酸定量儀檢測OD260/OD280的值為1.8～2.1。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(20 μl體系，4 μl RNA模板)。qRT-PCR檢測WWOX水平。WWOX上游引物:5′-CACGCATTTTAGAAGAATGG-3′，下游引物:5′-GACAGCAGCACAGTACACG-3′。β-actin上游引物:5′-CGGGAAGGCTTGTGATCAATGG-3′，下游引物:5′-GGCAGTGATGGCATGGACTG-3′。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性3 min；(95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s)×40個(gè)循環(huán)。

1.4Westernblotting檢測WWOX、MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin水平Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72 h，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入含有苯甲基磺酰氟(phenylemthanesulfonyl flyoride，PMSF)的裂解液，放在冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集上清溶液，保存溫度為-20 ℃。BCA法對蛋白進(jìn)行定量。蛋白變性：將蛋白樣品與5×Loading buffer混合煮沸。蛋白電泳：用12%的分離膠和4%的濃縮膠，100 V電壓電泳。轉(zhuǎn)膜：400 mA轉(zhuǎn)膜60 min。免疫反應(yīng)：含質(zhì)量濃度為50 g/L的牛血清白蛋白室溫孵育90 min；與1∶500稀釋的WWOX、1∶800稀釋的MMP-2、1∶800稀釋的MMP-9、1∶500稀釋的Vimentin、1∶500稀釋的E-cadherin于4 ℃孵育過夜，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育90 min。轉(zhuǎn)移到暗室中，ECL發(fā)光，以β-actin為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)水平。

1.5CCK8檢測細(xì)胞增殖Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/ml接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100 μl，培養(yǎng)72 h后，把培養(yǎng)液吸除，加入10 μl的CCK8，錫箔紙包好，避光孵育3 h，檢測450 nm的吸光度值(Absorbance，A值)。

1.6Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲把Transwell小室置于培養(yǎng)板，在小室的上室中加入不含血清的培養(yǎng)液300 μl將基質(zhì)膠水化，室溫條件下孵育2 h。將Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液制成5×105個(gè)細(xì)胞/ml濃度的細(xì)胞懸浮液。在Transwell小室的上室加入300 μl細(xì)胞懸浮液，在下室中加入含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液500 μl，培養(yǎng)24 h，在24孔板中加入500 μl的結(jié)晶紫染液，染色20 min，用水漂洗后，在顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野(200×)，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.7細(xì)胞劃痕檢測細(xì)胞遷移Control、pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為5×105個(gè)/孔，過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞完全鋪滿。用槍頭垂直的劃出細(xì)痕，用PBS將劃落的細(xì)胞吸掉，加入不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別在0 h和24 h測量劃痕寬度。細(xì)胞遷移率=[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)÷0 h劃痕寬度×100%]。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中WWOX水平pcDNA3.1細(xì)胞中WWOX mRNA和蛋白水平與Control相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.316、0.243，P>0.05)。pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞中WWOX mRNA和蛋白水平與Control相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.626、11.035，P<0.05)(見圖1、表1)。提示pcDNA3.1-WWOX可以提高膽囊癌細(xì)胞中WWOX水平。

2.2WWOX抑制膽囊癌細(xì)胞增殖pcDNA3.1細(xì)胞A值與Control相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.521,P>0.05)。pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞A值與Control相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.866,P<0.05)(見表2)。提示提高膽囊癌細(xì)胞中WWOX水平后，膽囊癌細(xì)胞增殖能力降低。

圖1 Western blotting檢測細(xì)胞中WWOX水平 Fig 1 WWOX level detected by Western blotting

組別WWOX mRNAWWOX蛋白Control 1.000.45±0.05pcDNA3.11.04±0.120.43±0.05pcDNA3.1-WWOX2.85±0.241.36±0.16F值139.58883.010P值0.0000.000

表2 各組細(xì)胞A值變化Tab 2 The change of A value in each

2.3WWOX抑制膽囊癌細(xì)胞侵襲和遷移pcDNA3.1細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)目與Control相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.571、0.227，P>0.05)。pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)目與Control相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.280、3.339,P<0.05)(見表3)。提示提高膽囊癌細(xì)胞中WWOX水平后，膽囊癌細(xì)胞侵襲和遷移能力降低。

2.4WWOX抑制膽囊癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin表達(dá)pcDNA3.1細(xì)胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin水平與Control相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。pcDNA3.1-WWOX細(xì)胞MMP-2、MMP-9、Vimentin與Control相比明顯降低，E-cadherin水平與與Control相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表4、圖2)。提示提高膽囊癌細(xì)胞中WWOX水平后，膽囊癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Vimentin表達(dá)水平下降，細(xì)胞中E-cadherin水平升高。

組別遷移率/%侵襲細(xì)胞數(shù)目Control52.82±4.65115.25±14.05pcDNA3.151.17±3.69117.47±13.26pcDNA3.1-WWOX34.68±1.5282.64±7.48F值24.1177.974P值0.0010.020

圖2 Western blotting檢測MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白水平 Fig 2 MMP-2, MMP-9, E-cadherin, Vimentin protein

組別MMP-2MMP-9E-cadherinVimentinControl0.68±0.080.62±0.040.82±0.091.05±0.11pcDNA3.10.69±0.05#0.60±0.07#0.81±0.07#1.02±0.12#pcDNA3.1-WWOX0.25±0.04*0.41±0.03*1.45±0.12*0.42±0.08*F值54.08616.33844.15734.550P值0.0000.0040.0000.001

注：與Control相比，t1=0.207，t2=0.493，t3=0.128，t4=0.351，#P>0.05；與Control相比，t1=8.902，t2=5.179，t3=8.074，t4=7.368，*P<0.05。

3 討論

WWOX基因定位于染色體16q23.3，含有9個(gè)外顯子，其內(nèi)顯子5和8是染色體脆性位點(diǎn)，也是轉(zhuǎn)移和斷裂發(fā)生最多的位置，WWOX蛋白含有WW結(jié)構(gòu)域和氧化還原結(jié)構(gòu)域，WW結(jié)構(gòu)域能夠與富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從肝癌中擴(kuò)增出來的Hep27蛋白也含有氧化還原結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域均與腫瘤密切相關(guān)[8-9]。研究[10]顯示，WWOX在多種癌癥中表達(dá)下調(diào)。BEDNAREK等[11]在卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤等細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)WWOX基因外顯子丟失，其mRNA中有異常的剪切體。WWOX基因能夠調(diào)控癌細(xì)胞的生長、凋亡、侵襲及遷移能力[12]。有研究[13]報(bào)道稱，WWOX基因可以誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞凋亡，抑制膽囊癌細(xì)胞生長，在膽囊癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究結(jié)果顯示，WWOX基因過表達(dá)后的膽囊癌細(xì)胞增殖能力下降，與上述報(bào)道相符合。

腫瘤細(xì)胞惡性增殖，分化異常，浸潤至周圍或向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是腫瘤的特點(diǎn)，腫瘤的遷移和侵襲是一個(gè)復(fù)雜過程，細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞黏附、基底膜等均參與其中[14]。細(xì)胞脫落是腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步；腫瘤細(xì)胞因其黏附性下降，從原發(fā)部位脫落，細(xì)胞表面的細(xì)胞因子可以與細(xì)胞外基質(zhì)或是基底膜結(jié)合，分泌膠原酶，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)；在循環(huán)系統(tǒng)中，腫瘤細(xì)胞可以與血小板結(jié)合，進(jìn)入血管或者淋巴管中，到達(dá)新的組織后繼續(xù)增殖形成轉(zhuǎn)移灶[15]。本研究顯示，WWOX基因過表達(dá)后的膽囊癌細(xì)胞侵襲和遷移能力均下降，說明WWOX除了可以抑制膽囊癌細(xì)胞生長外，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類需要依賴金屬離子如鈣離子、鋅離子等的蛋白水解酶類，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用[16]。腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力具有相關(guān)性，基質(zhì)金屬蛋白酶水平越高，腫瘤的侵襲能力也越強(qiáng)[17]。在人類中目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有23種基質(zhì)金屬蛋白酶，這些蛋白酶成員一般都含有前肽區(qū)、疏水信號肽序列、與鋅離子結(jié)合的催化活性區(qū)、與酶特異性底物有關(guān)的羧基末端、含有大量脯氨酸的鉸鏈區(qū)共5個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在維持蛋白酶結(jié)構(gòu)、活性及蛋白功能發(fā)揮過程中發(fā)揮重要作用[18]。MMP-9和MMP-2是研究最多的基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，具有破壞基底膜、降解外基質(zhì)的作用，在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮促進(jìn)作用[19]。上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型是腫瘤侵襲和遷移的前提，其可以使上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，從而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，而Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物[20]。研究[21]顯示，E-cadherin在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，Vimentin在腫瘤組織中表達(dá)升高。本研究結(jié)果顯示，WWOX可以降低膽囊癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平，提高細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平，減弱細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)，說明WWOX可以阻礙膽囊癌降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型。

綜上，WWOX抑制膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，降低膽囊癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Vimentin水平，促進(jìn)細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，WWOX可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶介導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞侵襲和遷移，抑制上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型。本研究結(jié)果為探討WWOX在膽囊癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用奠定了基礎(chǔ)，對于膽囊癌的治療具有重要意義。