賈春麗，楊穎，張華，李志鵬，楊志芳，張瑞麗，趙化榮，毛睿，才層，包永星

本研究創(chuàng)新點：

（1）本研究首次證實肝細胞癌（HCC）患者血漿中表達肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1），其高表達預(yù)示患者生存期短且為患者預(yù)后的獨立影響因素；（2）本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿MALAT1表達水平與HCC不同腫瘤分期及有無轉(zhuǎn)移相關(guān)；（3）本研究創(chuàng)新性地證實MALAT1與參與HCC發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中的相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）呈正相關(guān)，從而提示MALAT1可能協(xié)同上述蛋白促進腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200 nt且不具備編碼蛋白質(zhì)功能的RNA，在機體的多種病理生理活動調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用［1］。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）是lncRNA中的一員，又被稱為NEAT2，最早在一例發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的肺癌患者的腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)，位于11號染色體的長臂［2］，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)MALAT1在食管癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均有表達，并且與細胞周期調(diào)控、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、放化療敏感性及患者預(yù)后等密切相關(guān)［3］。肝細胞癌（HCC）是常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例數(shù)＞70萬，病死率居惡性腫瘤的第二位，而每年的新發(fā)病例及死亡病例有一半在中國［4］。已有學(xué)者研究證實MALAT1在肝癌組織中的表達水平高于癌旁組織［5］。另外針對肝癌組織中MALAT1表達水平的研究證實，MALAT1與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且可作為HCC患者預(yù)后的標(biāo)志物［6-7］。本研究通過檢測HCC患者血漿中MALAT1的表達水平，分析其與患者臨床特征及血清基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的關(guān)系，以探討HCC患者血漿MALAT1在臨床中的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2015年4月—2017年4月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)病理診斷為HCC的120例患者的血漿及血清樣本。其中男77例，女43例；年齡24～81歲，中位年齡64歲；按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）標(biāo)準分期：Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期79例；Child-Pugh分級A級77例，B～C級43例；病理分級G1～G2 71例，G3～G4 49例；HBV感染81例，無HBV感染39例；有肝硬化77例，無肝硬化43例；有轉(zhuǎn)移49例，無轉(zhuǎn)移71例。

1.2 血漿MALAT1表達水平檢測 采用實時熒光定量聚核酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）檢測血漿MALAT1表達水平。收集HCC患者血液標(biāo)本，以200 r/min（離心半徑20 cm）離心10 min，取上層血漿，按TRIZOL（美國Invitrogen 公司）說明書提取血漿中總RNA。采用takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供試劑，配置反應(yīng)體系，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄體系將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用TaqMan 實時反轉(zhuǎn)錄熒光PCR法在ABI7900熒光PCR儀上檢測擴增的特定DNA片段的濃度。引物序列通過查閱文獻［5］設(shè)計，由上海生工公司合成。引物序列為MALAT1上游引物：5'-ACTACCAGCCATTTCTCC-3'；MALAT1下游引 物：5'-ACCACCACAGGTTTACAG-3'。 采 用 2_??Ct法計算MALAT1的表達水平。

1.3 血清MMP9、VEGF表達水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（abcam公司）測定血清MMP9、VEGF表達水平。將樣本和標(biāo)準品分別加入96孔板并搖勻，室溫中靜置30 min。用沖洗液沖洗微孔板2遍，加入標(biāo)記二抗50 μl，室溫孵育2 h。再次沖洗4遍，加入標(biāo)記二抗室溫孵育30 min。振蕩混勻后在酶標(biāo)儀上450 nm處測定吸光度值。

1.4 隨訪 所有患者隨訪至2017年7月，采取以電話隨訪為主，同時結(jié)合門診隨訪、調(diào)閱住院病歷的方式進行隨訪。以病理確診為隨訪起點至患者死亡或截至隨訪日期計算隨訪時間。隨訪時間3～27個月，中位隨訪時間10.6個月。截至隨訪日期，所納入的患者死亡89例，存活28例，失訪3例。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（± s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用COX多因素回歸分析分析影響患者預(yù)后的因素；采用Pearson相關(guān)分析進行兩變量之間的相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALAT1、MMP9及VEGF在HCC患者血漿/血清中的表達水平 MALAT1在HCC患者血漿中的表達水平為（9.49±5.43）。根據(jù)MALAT1表達水平的中位數(shù)將患者分為MALAT1高、低表達組，MALAT1高表達組MALAT1表達水平為（14.32±2.81），MALAT1低表達組MALAT1表達水平為（4.65±2.00）；兩組MALAT1表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.909，P＜0.01）。血清MMP9表達水平為（409.73±322.85）mg/L， 血 清 VEGF表 達 水 平 為（469.40±299.39）ng/L。

2.2 MALAT1與HCC患者臨床特征的關(guān)系 MALAT1高、低表達組腫瘤分期、轉(zhuǎn)移情況比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組性別、年齡、Child-Pugh分級、病理分級、血清AFP表達水平、HBV感染、肝硬化情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.3 HCC患者預(yù)后影響因素的COX多因素回歸分析以患者的生存狀況為因變量（賦值:生存=0，死亡=1），以性別（賦值:女=0，男=1）、年齡（賦值：＜60歲=0，＞60歲=1）、腫瘤分期（賦值：Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1）、Child-Pugh分級（賦值：Child-Pugh分級A級=0，Child-Pugh分級B～C級=1，）、血清AFP水平（賦值：＜400 mg/L=0，＞400 mg/L=1）、病理分級（賦值：G1～G2=0，G3～G4=1）、HBV感染（賦值：無HBV感染=0，有HBV感染=1）、肝硬化（賦值：無肝硬化=0，有肝硬化=1）、有無轉(zhuǎn)移（賦值：無轉(zhuǎn)移=0，有轉(zhuǎn)移=1）、MALAT1表達水平（賦值:MALAT1低表達=0， MALAT1高表達=1）為自變量。COX多因素回歸分析結(jié)果顯示，患者年齡、腫瘤分期、Child-Pugh分級、有無轉(zhuǎn)移、血漿MALAT1表達水平為HCC患者預(yù)后的獨立影響因素（P＜0.05，見表2）。

2.4 血漿MALAT1表達水平與HCC患者臨床預(yù)后的關(guān)系 兩組患者生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.228，P＜0.010，見圖 1）。

2.5 血漿MALATl表達水平與血清MMP9、VEGF表達水平的相關(guān)性 血漿MALAT1表達水平與血清MMP9表達水平呈正相關(guān)（r=0.858，R2=0.641，P＜0.010，見圖2）。血漿MALAT1與血清VEGF表達水平呈正相關(guān)（r=0.301，R2=0.053，P＜0.010，見圖 3）。

表1 MALAT1與HCC患者臨床特征的關(guān)系﹝n（%）﹞Table 1 Correlation between MALAT1 and clinical characteristics of HCC patients

圖1 MALAT1高表達組與MALAT1低表達組HCC患者的生存曲線Figure 1 Survival curves for the MALAT1 high expression and low expression groups

圖2 血漿MALAT1表達水平與血清MMP9表達水平的相關(guān)性Figure 2 Correlation between plasma MALAT1 and serum MMP9

圖3 血漿MALAT1表達水平與血清VEGF表達水平的相關(guān)性Figure 3 Correlation between plasma MALAT1 and serum VEGF

表2 HCC患者預(yù)后影響因素的COX多因素回歸分析Table 2 COX multivariate analysis of prognostic factors in patients with HCC

3 討論

我國是全球肝癌新增病例數(shù)和死亡人數(shù)最多的國家，HCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移顯著降低了患者的遠期生存率［8］。雖然當(dāng)前臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諸多生物標(biāo)志物與肝癌的診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)，但這些標(biāo)志物的實際臨床應(yīng)用仍需要進一步的研究。因此，尋找新的肝癌腫瘤生物標(biāo)志物及進一步深入研究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制具有重要意義。

2003年JI等［6］首次通過基因組測序和RT-PCR發(fā)現(xiàn)了MALAT1，并且發(fā)現(xiàn)其與早期肺腺癌的轉(zhuǎn)移和患者生存期緊密相關(guān)。隨著對MALAT1的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)MALAT1與多種腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)。沉默人宮頸癌細胞中MALAT1的表達可抑制細胞的增殖、降低細胞侵襲能力［9］。OKUGAWA等［10］發(fā)現(xiàn)MALAT1參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，促進了腹膜轉(zhuǎn)移。MALAT1定位于細胞核核小體的核心區(qū)，該區(qū)域參與基因的聚集、修飾、加工和儲存，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮了重要的作用［11］。沉默人肝癌細胞株HepG2中MALAT1的表達可抑制其細胞活性、遷移和侵襲能力，并促進細胞凋亡［12］。

對HCC患者血漿中MALAT1的檢測發(fā)現(xiàn)，MALAT1在血漿中有表達，有學(xué)者證實MALAT1在肝癌組織中有表達且表達水平較癌旁組織高［5］，推測HCC患者肝癌組織及血漿中MALAT1的表達水平可能均升高。本研究結(jié)果顯示：MALAT1在HCC有轉(zhuǎn)移的患者中表達水平更高。在細胞水平運用以慢病毒為載體的基因干擾技術(shù)降低肝癌細胞中MALAT1的表達，發(fā)現(xiàn)細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力隨之降低，提示HCC患者血漿MALAT1也與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)，進一步表明MALAT1可能參與HCC的轉(zhuǎn)移過程［5，13］。本研究結(jié)果顯示，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期患者血漿MALAT1表達水平高于腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期者，這可能與MALAT1促進了HCC的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

有研究顯示，HCC患者組織中MALAT1的表達水平上調(diào)能夠預(yù)測肝癌切除術(shù)后及肝癌肝移植手術(shù)后患者較低的存活率，是肝癌切除術(shù)后及肝癌肝移植手術(shù)后患者預(yù)后的獨立危險因素［7，13］。本研究采用COX多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)血漿MALAT1表達水平是HCC患者預(yù)后的獨立影響因素，血漿MALAT1表達水平高者生存時間更短。由此表明HCC患者血漿中與組織中MALAT1的表達水平均對患者的預(yù)后有預(yù)測價值，且是患者的不良預(yù)后因素之一。

腫瘤的浸潤和侵襲過程中重要環(huán)節(jié)之一是降解細胞外基質(zhì)（ECM），ECM的降解主要依賴蛋白水解酶。金屬蛋白酶（MMPS）是由多個成員組成的蛋白水解酶家族。MMP9是MMPS成員之一，降解ECM中的Ⅳ型膠原，在腫瘤細胞侵襲基膜過程中起著關(guān)鍵作用。MMP9與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系在多個腫瘤的細胞系中被證實［14］。VEGF是由血管內(nèi)皮細胞分泌的促進細胞分裂能力的因子，在體內(nèi)特異性地促進內(nèi)皮細胞分裂，增大毛細血管通透性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞運動及新生血管的生成［15］，血漿VEGF水平與腫瘤體積、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈正相關(guān)［16］。為了進一步探究MALAT1與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程的關(guān)系，本研究測定了血清中上述指標(biāo)的表達水平，發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿MALAT1表達水平與血清MMP9、VEGF表達水平呈正相關(guān)，從而提示MALAT1與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系，可能是協(xié)同MMP9、VEGF降解ECM、參與腫瘤血管新生過程。

綜上所述，血漿MALAT1與HCC患者的預(yù)后相關(guān)，血漿MALAT1高表達的HCC患者生存期短，并且HCC患者血漿MALAT1表達水平和血清MMP9、VEGF表達水平具有一致性，提示MALAT1與MMP9、VEGF在HCC的發(fā)生、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移過程中可能具有協(xié)同作用。檢測血漿MALAT1表達水平可預(yù)測患者的預(yù)后及轉(zhuǎn)移。相對于檢測組織中MALAT1表達水平，檢測血漿MALAT1表達水平是一種簡便易行且創(chuàng)傷小的的方式。本研究僅對檢測了HCC患者血漿MALAT1表達水平，未對組織中MALAT1表達水平進行檢測，兩者的表達是否具有一致性需進一步研究。其次，本研究發(fā)現(xiàn)MALAT1表達水平與血清MMP9、VEGF表達水平具有相關(guān)性，但是具體作用機制及其在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用需要通過實驗來探究，有可能為降低肝癌的侵襲能力、阻斷肝癌的轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點。

本文不足：

（1）僅對HCC患者血漿中MALAT1的表達水平進行檢測，沒有同時檢測組織中的表達水平，兩者的關(guān)系需進一步研究；（2）雖證實了MALAT1和血清MMP9、VEGF有關(guān)聯(lián)，但三者協(xié)同參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程的機制尚不明確，進一步研究該過程有可能為尋找肝癌治療新的突破點提供依據(jù)。

作者貢獻：賈春麗進行文章的設(shè)計與構(gòu)思，撰寫文章；楊穎及張華負責(zé)指標(biāo)檢測；趙化榮、毛睿負責(zé)實驗操作；李志鵬、楊志芳負責(zé)實驗標(biāo)本的收集；張瑞麗負責(zé)實驗資料的整理與分析；才層進行論文的修訂；包永星進行文章的審校與質(zhì)量控制。

本文無利益沖突。