(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 肝膽外科,四川 瀘州 646099)
肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國最常見的消化系統惡性腫瘤之一[1-2]。編碼基因位于人類染色體1q21上的SET結構域分支型1(SET domain bifurcated 1, SETDB1)是一種組蛋白賴氨酸N端甲基轉移酶[3-5]。有研究顯示,前列腺癌及非小細胞肺癌中高表達的SETDB1對腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲具有促進作用,并且能對患者預后進行評價[6-7]。本研究檢測HCC中SETDB1的表達,通過敲除SETDB1研究其對肝癌細胞體內外增殖凋亡能力的影響。
1.1.1 臨床資料 選取2014年1月-2016年3月于西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科行手術切除的50例HCC患者的組織標本及35例因肝外傷或肝血管瘤而切除患者的正常肝組織標本。所有標本于離體30 min內取材,于中性甲醛溶液中保存、固定。
1.1.2 細胞來源及主要試劑 肝癌MHCC97H細胞購自上海細胞庫,并由本科實驗室保存。SETDB1特異性shRNA慢病毒顆粒(病毒載體類型:psi-LVRH1GP)購自廣州復能基因公司,DMEM(11965-084)、胎牛血清(16000044)購自美國Gibco公司,Annexin V凋亡檢測試劑盒(FITC/PI雙染法,E606336)購自上海生工生物工程有限公司,Trizol試 劑(15596026)、RT-PCR試劑盒(SuperScript?One-Step RT-PCR System with Platinum? Taq DNA Polymerase, 10928042) 及qPCR試劑盒(DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit, F415L)購自美國Invitrogen公司,兔抗人SETDB1單克隆抗體(#2196)、兔抗人組蛋白H3單克隆抗體(#9717)、兔抗人H3K9me3單克隆抗體(#13969)、兔抗人p53單克隆抗體(#2527)及兔抗人β-actin單克隆抗體(#4970)購自美國CST公司;兔SP免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。
將石蠟包埋的標本組織切片常規(guī)進行脫蠟及水化預處理;用抗體稀釋液按1∶100比例稀釋兔抗人SETDB1多克隆抗體,滴加抗體于組織切片上并充分浸沒組織標本。4℃恒溫冰箱內孵育過夜,洗凈未結合一抗后,使用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗結合相應一抗,DAB法顯示陽性蛋白。每張組織切片在400倍視野下隨機選取10個視野進行閱片。>10%癌細胞胞核呈棕黃色或棕褐色染色即為陽性,否則判定為陰性。
MHCC97H細胞于適宜環(huán)境中培養(yǎng),穩(wěn)定傳2代或3代后進行實驗。將MHCC97H細胞按過夜增殖至愈合度達70%的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板。達到預定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS)充分洗滌細胞。慢病毒感染分組:每孔加入1 ml sh-SETDB1慢病毒上清液、2 ml完全培養(yǎng)基及15μg Ploybrene作為sh-SETDB1組;每孔加入1 ml sh-Control慢病毒上清液、2 ml完全培養(yǎng)基及15μg Ploybrene作為sh-Control組。轉染48 h后,使用含2μg/ml Puromycin的完全培養(yǎng)液篩選穩(wěn)定轉染細胞株。
通過Trizol試劑提取標本及細胞RNA,配制逆轉錄及PCR擴增體系。逆轉錄條件:50℃預變性30 min,94℃變性2 min,循環(huán)1次后94℃變性15 s,60℃退火30 s,68℃延伸3 min,循環(huán)40次后72℃繼續(xù)延伸10 min。通過2-△△Ct法計算SETDB1基因的相對含量。
采用RIPA試劑提取細胞總蛋白,凝膠垂直電泳分離蛋白,70 V恒壓轉膜150 min,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)室溫封閉1 h;用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋SETDB1、H3K9me3、p53及β-actin抗體。在4℃下孵育相應條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內,增強化學發(fā)光法觀察蛋白表達。每個樣本獨立重復實驗3次。
將MHCC97H細胞按500個/孔均勻接種于6孔板中,更換完全培養(yǎng)基2次/周。培養(yǎng)2周后,使用4%多聚甲醛固定細胞30 min,1%結晶紫染色15 min,置于蒸餾水中洗去多余染液。風干后將6孔板置于網格紙上統計每孔克隆形成數量,計算克隆形成率。每個樣本獨立重復實驗3次。
將MHCC97-H細胞用預冷PBS工作液沖洗2次,胰酶消化細胞后1 500 r/min離心5 min沉淀細胞,預制緩沖液調整細胞數為1×106個/ml,將500μl細胞懸液與5μl Annexin V-FITC及10μl PI混合,室溫遮光反應10 min后上機測試。
6只5周齡BLAB/c裸鼠,隨機分為sh-SETDB1組和sh-Control組,每組3只,分組后各組適應性飼養(yǎng)1周。分別取對數生長期的sh-SETDB1和sh-Control細胞,以冷PBS溶液制成細胞懸液,調整細胞終濃度為2.0×107個/ml。使用1 ml注射器,將0.2 ml細胞懸液(約含4.0×106個細胞)接種于裸鼠背部近右下肢處皮下組織內,復制裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠飼養(yǎng)4周,每周測量腫瘤長度及寬度,按(長軸×短軸2)/2來計算腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線。
數據分析采用SPSS 13.0統計學軟件,計量資料以均數±標準差(±s)表示,比較用t檢驗或單因素方差分析,計數資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。
免疫組織化學染色發(fā)現,SETDB1位于細胞核。50例HCC組織中SETDB1蛋白的陽性表達率為80.00%(40/50),35例正常肝組織中SETDB1蛋白的陽性表達率為31.43%(11/35),經χ2檢驗,差異有統計學意義(χ2=20.238,P=0.000)。見圖1。
圖1 SETDB1在HCC和正常肝組織中的表達
HCC組織中不同直徑腫瘤比較,差異有統計學意義(P<0.05),SETDB1陽性表達與腫瘤體積增大關系密切。見表1。
表1 不同影響因素下的SETDB1陽性表達率比較
sh-Control組SETDB1 mRNA相對表達量為(1.00±0.00),sh-SETDB1組 為(0.38±0.11), 經t檢驗,差異有統計學意義(t=5.219,P=0.017)。sh-Control組SETDB1蛋白相對表達量為(0.46±0.08),sh-SETDB1組為(0.17±0.02),經t檢驗,差異有統計學意義(t=3.071,P=0.036)。sh-SETDB1組抑制MHCC97H細胞克隆率為(81.34±10.29)%,sh-Control組為(53.22±8.31)%,經t檢驗,差異有統計 學 意 義(t=4.025,P=0.029)。sh-SETDB1組 促進MHCC97H細胞凋亡率為(31.45±6.19)%,sh-Control組為(18.08±5.33)%,經t檢驗,差異有統計學意義(t=3.740,P=0.031)。見圖 2。
圖2 沉默SETDB1表達對MHCC97H細胞增殖、凋亡的影響
sh-SETDB1組MHCC97H細胞在裸鼠體內的生長速度為(0.010±0.004)cm3/d,sh-Control組為(0.050±0.010)cm3/d,經t檢驗,差異有統計學意義(t=23.605,P=0.039)。飼養(yǎng)4周后處死動物獲取皮下腫瘤,sh-SETDB1組最終腫瘤體積為(1.34±0.31)cm3,sh-Control組為(0.41±0.12)cm3,經t檢驗,差異有統計學意義(t=3.581,P=0.031)。見圖3。
sh-Control組MHCC97H細胞中H3K9me3的表達水平為(0.73±0.09),sh-SETDB1組為(0.13±0.02),經t檢驗,差異有統計學意義(t=4.427,P=0.025)sh-Control組 p53的表達水平為(0.67±0.06),sh-SETDB1組 為(0.21±0.04), 經t檢 驗, 差異有統計學意義(t=3.060,P=0.041),sh-Control組H3的表達水平為(0.42±0.03),sh-SETDB1組為(0.39±0.02),兩組比較,差異無統計學意義(t=1.036,P=0.205)。SETDB1并未調控組蛋白H3的表達,而是通過調控組蛋白H3甲基化抑制p53的表達,促進腫瘤細胞增殖。見圖4。
圖3 沉默SETDB1表達對MHCC97H細胞移植瘤生長的影響
圖4 沉默SETDB1表達對MHCC97H細胞內H3K9me3和p53表達的影響
SETDB1作為一種蛋白甲基化轉移酶,實驗證據表明其能與異染色質蛋白1及其共抑制子KAP1在異染色質中結合而促進H3K9me3形成[8-9]。本研究的免疫組織化學染色結果顯示,50例HCC組織中SETDB1的陽性表達率要高于35例正常肝組織,并且高表達SETDB1的患者腫瘤體積增大。說明在臨床上檢測肝癌組織中SETDB1的表達對判斷患者腫瘤進展有一定參考價值。
目前,雖然在許多腫瘤中都發(fā)現了SETDB1的異常表達,但是其具體的生物學功能尚不完全清楚[10]。在非小細胞肺癌中,SETDB1通過正向激活WNT-βcatenin信號通路來促進HCC細胞增殖,相似的生物學作用也存在于腦膠質母細胞瘤中[11-12]。但是WU等[13]的研究結果卻指出,SETDB1能與SMAD2和SMAD3形成SETDB1/SMAD2/3抑制性復合體來抑制TGF-β誘導的肺癌細胞轉移。在本研究中,筆者通過細胞增殖及凋亡實驗表明,體外沉默SETDB1的表達致使肝癌MHCC97H細胞的增殖能力受到抑制。除此之外,動物腫瘤生長模型也指明,下調SETDB1的表達能夠抑制MHCC97H細胞在體內的生長。綜合上述結果表明,下調SETDB1的表達是抑制肝癌生長的有效手段之一。SETDB1能夠特異性甲基化組蛋白H3的K9位點,形成甲基化的組蛋白H3K9me3。有研究指出,H3K9me3的形成與包括p53在內的許多抑制腫瘤細胞生長的基因失活有關[14]。在本研究中,筆者在沉默SETDB1表達后發(fā)現H3K9me3的表達水平降低,而p53的表達水平升高,提示SETDB1促腫瘤生長可能與抑制p53的表達有關。另外,p53在肺癌中還可能作為一種轉錄抑制因子結合在SETDB1的啟動子區(qū)域,抑制其轉錄過程[15]。說明p53與SETDB1存在復雜的相互制約關系。在HCC中p53的失活是一種普遍現象,這也部分揭示了SETDB1在HCC中高表達的原因[16]。
綜上所述,SETDB1是HCC中高表達的促癌分子,沉默SETDB1的表達可能通過恢復p53的表達而抑制HCC增殖并促進其凋亡。