李浩，戴世龍，趙宇，許博文，張青松

（1.河北省開(kāi)灤總醫(yī)院 普外科，河北 唐山 063000；2.華北理工大學(xué) 研究生學(xué)院，河北唐山 063210）

乳腺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，部分患者確診時(shí)腫瘤已浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，因此尋找有效的治療中、晚期腫瘤的藥物具有重要意義。三溴丙酮酸（3 bromopyruvate, 3-BrPA）是可促進(jìn)凋亡或自噬的抗腫瘤新藥[1-2]。目前，對(duì)其抑制腫瘤增殖及侵襲的機(jī)制知之甚少。真核轉(zhuǎn)錄起始因子5A2（eukaryotic translation initiation factor 5A2, eIF5A2）、c-myc基 因及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1（metastasis-associated protein 1,MTA1）在腫瘤增殖、侵襲中起重要作用[3]。3-BrPA是否通過(guò)該途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究3-BrPA對(duì)eIF5A2、c-myc基因、MTA1表達(dá)的影響，探討其抑制腫瘤增殖、侵襲的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株及儀器 乳腺癌MCF-7細(xì)胞株由華北理工大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器 iMark酶標(biāo)儀、Mini-Protean Tetra System、Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell購(gòu) 自美國(guó)伯樂(lè)公司，QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System（美國(guó)life公司），超速低溫離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司），Transwell小室（美國(guó)Costar公司）。

1.1.3 主要試劑 3-BrPA（大連美侖生物技術(shù)有限公司），MTT（美國(guó)Sigma公司），胎牛血清（澳大利亞Bovogen Biologicals公司），Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司），eIF5A2、MTA1兔抗人單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），c-myc兔抗人多克隆抗體（美國(guó)Epitomics公司），β-actin鼠抗人單克隆抗體（臺(tái)灣Arigo公司）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒購(gòu)自大連寶生生物技術(shù)有限公司，RT-PCR特異性引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 乳腺癌MCF-7細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗），置于37℃、5%二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，2 d或3 d換液1次。待長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí)，按1∶2傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為5組：加入等量PBS的對(duì)照組，75、100、125和150μmol/L 3-BrPA組（實(shí)驗(yàn)組）。

1.2.2 MTT法 利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，將細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入等體積不同濃度的3-BrPA（以PBS稀釋?zhuān)?，?duì)照組加入等體積PBS，每組6個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)24、48和72 h后加入MTT 15μl/孔，37℃孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜 150μl/孔，搖床上震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處光密度值（optical density, OD值）。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Transwell實(shí)驗(yàn)，研究3-BrPA對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的影響。在上室中均勻加入Matrigel膠，加入100μl以無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的MCF-7細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約2×104個(gè)/孔；下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基600μl。細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組分別加入等體積的75、100和150μmol/L 3-BrPA溶液，對(duì)照組加入等體積PBS，常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，PBS清洗2遍或3遍，4%多聚甲醛固定10 min，用棉簽輕輕拭去室內(nèi)未侵襲出的細(xì)胞，瑞士-吉姆薩染色10 min后PBS清洗3遍，每個(gè)小室隨機(jī)取3個(gè)視野采集圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR 采用RT-PCR檢測(cè)eIF5A2、c-myc及MTA1基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組MCF-7細(xì)胞以100μmol/L 3-BrPA處理24 h，對(duì)照組加入與藥物等體積的PBS，提取細(xì)胞總RNA，純度控制在1.8～2.1。按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s；60℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)。以2%瓊脂糖凝膠電泳行熒光擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證。采用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，β-actin為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè) 采用 Western blot檢測(cè)eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白的表達(dá)。用藥物處理各組細(xì)胞24 h，BCA法定量提取蛋白，與5×上樣緩沖液按4∶1的比例混合均勻后煮沸3～5 min備用。制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育一抗過(guò)夜。TBST漂洗3次，5 min/次，搖床上二抗孵育2 h，TBST漂洗3次，5 min/次?；瘜W(xué)發(fā)光劑顯影，內(nèi)參選用β-actin，采用Image J軟件分析圖像灰度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3-BrPA對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

24、48和72 h時(shí)，5組MCF-7細(xì)胞存活率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3-BrPA作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞存活率降低，并具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，3-BrPA作用24 h時(shí)，75和100μmol/L 3-BrPA組細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藥物處理48 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；150與125μmol/L 3-BrPA組細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；3-BrPA作用于細(xì)胞72 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；75和100μmol/L 3-BrPA作用于細(xì)胞后，其存活率隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2和圖1。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)MCF-7細(xì)胞存活率比較 （%，±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)MCF-7細(xì)胞存活率比較 （%，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05

24 h 48 h 72 h對(duì)照組 100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 75μmol/L 3-BrPA組 94.85±6.20 83.00±2.60? 74.58±5.75?100μmol/L 3-BrPA組 82.4±12.59 68.79±6.07? 59.62±12.6?125μmol/L 3-BrPA組 26.38±10.16? 20.75±7.72? 17.83±3.82?150μmol/L 3-BrPA組 16.43±2.91? 12.37±3.18? 12.78±3.50?F值 152.206 394.904 191.023 P值 0.000 0.000 0.000組別

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)MCF-7細(xì)胞存活率比較 （±s）

2.2 3-BrPA對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲的影響

MCF-7細(xì)胞經(jīng)3-BrPA處理24 h時(shí)，對(duì)照組，以及75、100和150μmol/L 3-BrPA組細(xì)胞數(shù)分別為（281.67±18.77）、（159.00±24.06）、（76.33±9.07） 和（40.67±11.50）個(gè)，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=119.894，P=0.000），各組穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)不同。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)降低，且具有劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 3-BrPA對(duì)eIF5A2、c-myc及MTA1基因表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照組基因表達(dá)量為（1.000±0.000），則 100μmol/L 3-BrPA 組eIF5A2、c-myc及MTA1基因的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.764±0.088）、（0.735±0.144）和（0.606±0.095）。100μmol/L 3-BrPA作用24 h時(shí)的eIF5A2、c-myc及MTA1基因表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.664、3.186和7.170，P=0.010、0.033 和 0.019），100μmol/L 3-BrPA組較對(duì)照組降低。見(jiàn)圖3。

2.4 3-BrPA對(duì)eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表達(dá)的影響

MCF-7細(xì)胞經(jīng)3-BrPA處理24 h后，75和100μmol/L 3-BrPA組、對(duì)照組eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），75和 100μmol/L 3-BrPA 組較對(duì)照組降低。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，75μmol/L 3-BrPA組eIF5A2蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；100μmol/L 3-BrPA組eIF5A2蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，c-myc和MTA1蛋白表達(dá)量經(jīng)3-BrPA處理后均降低，且具有濃度依賴(lài)性（P＜0.05），其中MTA1蛋白降低更明顯。見(jiàn)表3和圖4。

圖2 3-BrPA作用24 h時(shí)各組MCF-7細(xì)胞侵襲情況 （×200）

圖3 對(duì)照組與100μmol/L 3-BrPA組eIF5A2、c-myc及MTA1基因相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 各組eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

表3 各組eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05

eIF5A2 c-myc MTA1對(duì)照組 0.971±0.102 1.029±0.112 1.549±0.045 75μmol/L 3-BrPA組 0.821±0.057 0.687±0.057? 1.049±0.125?100μmol/L 3-BrPA組 0.628±0.083? 0.516±0.069? 0.368±0.044?F值 12.976 29.749 160.834 P值 0.007 0.001 0.000組別

圖4 各組eIF5A2、c-myc及MTA1蛋白的表達(dá) （±s）

3 討論

乳腺癌發(fā)病率居女性腫瘤之首，且近10年仍有上升趨勢(shì)[4]。部分患者被確診為乳腺癌時(shí)，已發(fā)生浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此時(shí)化療具有重要意義。3-BrPA是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型有效的抗腫瘤藥物，目前處于研究階段，尚未進(jìn)入臨床應(yīng)用。以往的研究主要集中在對(duì)腫瘤糖代謝及凋亡方面的研究[5]，關(guān)于其抑制腫瘤增殖及侵襲的機(jī)制知之甚少。

eIF5A2在胃腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞性肺癌及食管癌等實(shí)體腫瘤中均有過(guò)表達(dá)[6]。eIF5A2過(guò)表達(dá)與患者生存期的縮短呈正相關(guān)，并且會(huì)增加腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。降低eIF5A2基因的表達(dá)，腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制。有研究表明，eIF5A2可通過(guò)c-myc調(diào)節(jié)MTA1的表達(dá)，來(lái)降低腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[7-8]。有研究表明，eIF5A2-c-myc/MTA1軸在腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖、遷移及侵襲中可能起重要作用[3]。MTA1為eIF5A2的下游靶點(diǎn)，下調(diào)MTA1的表達(dá)后，胰腺癌SW1900細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲作用受抑制，細(xì)胞凋亡率增加[9]。MENG等[10]研究提示，下調(diào)eIF5A2基因以降低CyclinD1、CyclinD3的表達(dá)，可抑制胰腺癌MKN28細(xì)胞的增殖；亦可通過(guò)eIF5A2抑制c-myc、MTA1的表達(dá)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑，降低其侵襲和遷移能力。XU等[11]通過(guò)miR-9靶向作用于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞eIF5A2基因后，細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化受抑制，增殖和遷移能力也降低。MENG等[8]通過(guò)siRNA抑制eIF5A2基因，可明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。

有研究表明，3-BrPA可以抑制MCF-7細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯在S期及G2/M期，并促進(jìn)其凋亡，該過(guò)程可能與降低Bcl-2、c-myc及突變型P53的表達(dá)有關(guān)[12]。依據(jù)MTT和Transwell結(jié)果，3-BrAP作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞，其增殖和侵襲能力降低；RTPCR和Western blot結(jié)果表明，3-BrPA作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞24 h，eIF5A2、c-myc、MTA1基因和蛋白表達(dá)水平降低，其中MTA1基因和蛋白降低更為明顯。

綜上所述，3-BrPA可以抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制可能與降低eIF5A2、c-myc、MTA1基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。目前，3-BrPA尚處于臨床前研究階段，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)效果均比較理想。由于3-BrPA在溶劑中的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，見(jiàn)光易分解。因此，解決藥物成藥問(wèn)題是其進(jìn)入臨床應(yīng)用的關(guān)鍵，也是下一步的研究重點(diǎn)。