田 敏， 楊 曉， 王繼華， 顧強(qiáng)鍵， 莫錫君

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650200； 2.云南豐島花卉有限公司，云南富民 650400)

菊花(Chrysanthemum×morifoliumRamat.)為菊科(Asteracceae)菊屬植物，是菊屬植物及由其變異、雜交形成的栽培品種的統(tǒng)稱[1]。菊花是中國(guó)傳統(tǒng)十大名花之一，具有豐富的文化內(nèi)涵[2]，也是世界四大切花之一，在世界花卉產(chǎn)業(yè)中的產(chǎn)量和產(chǎn)值均居于前列[3]。雜交育種是培育菊花新品種最主要的途徑[4]，但菊科植物的花粉屬于短壽命的三核型花粉，這種類型的花粉外壁較薄，對(duì)外界不良條件抵抗力較差，保存困難[5]。4、-20、-80 ℃條件保存后，菊花花粉生活力明顯降低，保存期不超過1個(gè)月[6-7]。超低溫保存(cryopreservation)技術(shù)能實(shí)現(xiàn)花粉的長(zhǎng)期保存，已成功應(yīng)用于許多植物[8]。超低溫保存是指在液氮-196 ℃或液氮蒸汽中保存生物材料，如細(xì)胞、組織、器官或者其他生物體的方法和技術(shù)。在液氮溫度下，細(xì)胞中所有的生物化學(xué)反應(yīng)包括細(xì)胞的程序死亡都被暫時(shí)停止，從而使細(xì)胞在理論上可以進(jìn)行無限期的保存[9]?；ǚ鄢蜏乇４婕夹g(shù)可以在不破壞種質(zhì)資源的前提下，最大限度地保存植物的種質(zhì)資源[10]。因此，花粉也是最早被保存的植物種質(zhì)[11]。通過超低溫保存花粉，可以解決雜交時(shí)花期不遇和地理隔離的問題，也可免去每年種植同一父本材料、取材時(shí)間受季節(jié)限制的問題，且花粉具有體量小、運(yùn)輸方便、可即時(shí)使用的特點(diǎn)，這對(duì)遠(yuǎn)緣雜交育種來說，其貢獻(xiàn)是非常大的[12]。一般成熟花粉具有高度的脫水耐受性，在完成脫水過程以后不須要經(jīng)過特殊處理即可放入液氮進(jìn)行超低溫保存，解凍時(shí)只須將其從液氮中取出在常溫下放置2 h左右即可用于試驗(yàn)或者授粉[8]，非常便利。我國(guó)目前進(jìn)行花粉超低溫保存的花卉有梅花[13-14]、山茶[15]、白掌[16]、芍藥[17]、牡丹[18-19]、紫花鳶尾[20]、榆葉梅和海棠[21]，其中只有梅花建立了超低溫花粉庫(kù)[22]。

切花菊遠(yuǎn)緣雜交首先要解決的就是時(shí)空隔離問題，表現(xiàn)為花期不遇和地理隔離：切花菊一般都屬于秋菊類，自然花期通常為7—11月，而須要與其雜交的亞菊屬、匹菊屬、蒿屬和蓍屬等大部分菊屬植物的自然花期是4—6月，造成花期不遇；另外菊屬的近緣屬中大部分屬為不連續(xù)分布，具有明顯的分布地域性，如亞菊屬分布在中國(guó)西北地帶、太行菊屬局限于中國(guó)中部等，從而造成不同屬間的地理隔離[23]。花粉保存可使原本花期不遇的遠(yuǎn)緣雜交親本能夠授粉，也可以儲(chǔ)藏并運(yùn)輸花粉使異地的遠(yuǎn)緣親本得以雜交，解決時(shí)空隔離的障礙。簡(jiǎn)單和高效的花粉長(zhǎng)期保存技術(shù)對(duì)切花菊的資源保存、雜交育種等相關(guān)研究和應(yīng)用具有重要意義。本研究用超低溫保存技術(shù)保存了8種切花菊的花粉，并用花粉活力檢測(cè)及在田間育種中驗(yàn)證了其有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集花粉的8個(gè)切花菊品種全為多頭類型切花菊品種，其中Amedia、Lisbon、Florange來自荷蘭Deliflor公司，Menalisa Pink來自荷蘭Dekker公司，CA-154、CA-308、CA-249和CA-7為云南豐島花卉有限公司的自育品種，這8個(gè)品種都種植在云南豐島花卉有限公司的切花菊生產(chǎn)基地。在田間育種試驗(yàn)中，雜交母本為Rodost，多頭切花菊類型，來自荷蘭Deliflor公司，種植在云南豐島花卉有限公司的切花菊生產(chǎn)基地。試驗(yàn)時(shí)間為2013年秋季至2016年春季；花粉收集地點(diǎn)、花粉超低溫保存及授粉地點(diǎn)為云南豐島花卉有限公司，花粉活力試驗(yàn)地點(diǎn)為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉收集 菊花花序中的兩性花即管狀花的雄蕊釋放花粉，在晴朗天氣的15：00時(shí)許放粉最盛。用干燥毛筆輕刷雄蕊，把花粉小心撥入培養(yǎng)皿中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。由于菊花頭狀花序上的管狀花從外向內(nèi)逐輪開放，因此須要連續(xù)幾天收集花粉。

1.2.2 花粉超低溫保存 將須要超低溫保存的花粉小心轉(zhuǎn)移到凍存管中，把凍存管放入液氮(LN2)罐中保存。定期補(bǔ)充液氮，保證花粉一直處于超低溫狀態(tài)。儲(chǔ)藏的菊花花粉解凍采用呂晉慧等的方法[6]，從液氮罐中取出裝有花粉的凍存管，于35 ℃解凍2 min。

1.2.3 切花菊花粉超低溫保存前后花粉活力的比較 為驗(yàn)證超低溫保存切花菊花粉的有效性，分別測(cè)定8個(gè)切花菊花粉超低溫保存前和保存后的花粉活力并進(jìn)行對(duì)比。因花粉離體萌發(fā)法更符合實(shí)際萌發(fā)情況[24]，所以本試驗(yàn)采取花粉離體萌發(fā)法進(jìn)行花粉活力測(cè)定。含有硼酸、蔗糖的通用培養(yǎng)基對(duì)許多二核花粉萌發(fā)效果很好，但對(duì)三核花粉的菊科萌發(fā)效果很差[25]。因此，菊花花粉萌發(fā)參照王四清等的方法[26]，采用改良的Monnier培養(yǎng)基(ME3)，在22～25 ℃、相對(duì)空氣濕度86%的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔1 h在顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)1次花粉萌發(fā)率，直至2次統(tǒng)計(jì)的萌發(fā)率基本相同為止，計(jì)算花粉的萌發(fā)率。花粉萌發(fā)的判定標(biāo)準(zhǔn)為花粉管長(zhǎng)度大于或等于花粉粒半徑。每個(gè)品種設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野200?；ǚ?，每個(gè)重復(fù)共約1 000個(gè)花粉粒，取4個(gè)重復(fù)的平均值計(jì)算該品種的花粉萌發(fā)率?；ǚ勖劝l(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/總花粉數(shù)×100%。

1.2.4 切花菊花粉超低溫保存前后雜交結(jié)實(shí)率的比較 為進(jìn)一步驗(yàn)證超低溫保存切花菊花粉的有效性和超低溫保存花粉用于雜交育種的可行性，從超低溫保存的8個(gè)切花菊花粉中隨機(jī)選擇2個(gè)切花菊品種的花粉，分別測(cè)定這2個(gè)切花菊的新鮮花粉和超低溫保存后花粉的授粉結(jié)實(shí)率并進(jìn)行對(duì)比。分別采用新鮮花粉和超低溫保存后的花粉，在云南豐島花卉有限公司的切花菊生產(chǎn)基地進(jìn)行授粉試驗(yàn)。根據(jù)菊花的開放特點(diǎn)，先將花瓣留1 cm左右剪短，露出花心，過1～2 d后雌蕊柱頭開展成“丫”形時(shí)，用毛筆蘸取花粉涂抹柱頭，每隔1 d后再次授粉1次，共進(jìn)行3次。因?yàn)榫栈ㄗ越徊挥H和[27]和有花瓣隔離，所以可以省掉去雄和套袋程序。每個(gè)雜交組合設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取約1 000個(gè)小花，授粉后進(jìn)行小花數(shù)量計(jì)數(shù)，取3個(gè)重復(fù)的平均值計(jì)算授粉花朵數(shù)。待種子成熟后收集種子，取3個(gè)重復(fù)的平均值計(jì)算結(jié)實(shí)數(shù)。結(jié)實(shí)率=結(jié)實(shí)數(shù)/總授粉花朵數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行處理分析，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 切花菊花粉超低溫保存前后花粉活力的比較

2013—2014年共保存8個(gè)切花菊品種花粉，8個(gè)品種都為多頭切花菊類型，超低溫保存時(shí)間分別為1年和1個(gè)月，采用離體萌發(fā)法進(jìn)行了超低溫保存前后的花粉活力測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)切花菊品種Amedia、Menalisa Pink、CA-154、CA-249 的花粉超低溫保存后的萌發(fā)率相比起超低溫保存前沒有顯著變化；3個(gè)切花菊品種Lisbon、Florange、CA-7的花粉超低溫保存后的萌發(fā)率相比起超低溫保存前顯著降低，但仍具有活力；1個(gè)切花菊品種CA-308花粉超低溫保存后的萌發(fā)率相比起超低溫保存前顯著升高(表1)。因此，在超低溫保存后，各品種的花粉都保持了一定的活力，品種的差異是影響其超低溫保存后花粉活力的主要因素。

表1 切花菊花粉超低溫保存前后的花粉萌發(fā)率

注：*表示在0.05水平差異顯著。下同。

2.2 切花菊花粉超低溫保存前后雜交結(jié)實(shí)率的比較

為進(jìn)一步驗(yàn)證超低溫保存切花菊花粉的有效性和超低溫保存花粉用于雜交育種的可行性，從超低溫保存的8個(gè)切花菊花粉中隨機(jī)選擇2個(gè)切花菊品種的花粉進(jìn)行田間雜交試驗(yàn)，超低溫保存時(shí)間為1個(gè)月和1年。選取的超低溫保存花粉(父本)為L(zhǎng)isbon(花朵紅色)和CA-7(花朵黃色)，雜交母本都為Rodost(花朵白色)，父母本都為多頭切花菊類型。在2014、2015年秋季分別進(jìn)行田間授粉，于次年統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以Lisbon為父本的雜交中，保存了1個(gè)月的花粉結(jié)實(shí)率和新鮮花粉相比顯著升高，保存1年后的花粉結(jié)實(shí)率和新鮮花粉相比沒有顯著變化；以CA-7為父本的雜交中，保存了1個(gè)月和1年后的花粉結(jié)實(shí)率和新鮮花粉相比沒有顯著變化。說明超低溫保存技術(shù)用于切花菊花粉的保存和田間雜交是有效的。切花菊授粉每隔1 d授粉1次，共進(jìn)行3次，因此超低溫保存后花粉的萌發(fā)率和用其授粉后的結(jié)實(shí)率沒有直接相關(guān)性。另外，由于所用雜交父母本都為多頭切花菊，頭狀花序高度瓣化，花朵較小即種子非常細(xì)??；而且結(jié)實(shí)率測(cè)定周期長(zhǎng)(從授粉到收獲種子100～110 d)，易受不同母本植株、授粉當(dāng)年冬季氣候環(huán)境的影響[28]，導(dǎo)致結(jié)實(shí)數(shù)和結(jié)實(shí)率的統(tǒng)計(jì)難免不太準(zhǔn)確，該數(shù)值只能作為參考。后續(xù)繼續(xù)用其他超低溫保存品種的花粉進(jìn)行田間雜交試驗(yàn)都有結(jié)實(shí)，證實(shí)花粉超低溫保存技術(shù)可用于切花菊花粉的長(zhǎng)期保存和雜交育種。

表2 超低溫保存的切花菊花粉授粉后的結(jié)實(shí)率

2.3 多重花粉管現(xiàn)象

在8個(gè)切花菊品種花粉超低溫保存后的離體萌發(fā)試驗(yàn)中，Lisbon(圖1)和Florange(圖2)2個(gè)品種的花粉萌發(fā)存在多重花粉管現(xiàn)象，主要為二重花粉管和三重花粉管，這可能與花粉粒儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量有關(guān)[29]。通常情況下，花粉只有1個(gè)萌發(fā)孔、1條花粉管，但偶爾會(huì)有多重花粉管現(xiàn)象，即在花粉粒上不止1個(gè)萌發(fā)孔。多重花粉管中只有1個(gè)能夠到達(dá)細(xì)胞核，其他都會(huì)被抑制[30]?；ǚ垭x體培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的多重花粉管現(xiàn)象會(huì)多于活體萌發(fā)[31]。其他6個(gè)品種超低溫保存后的花粉沒有觀察到多重花粉管現(xiàn)象，因此并不能判定超低溫保存是引起多重花粉管現(xiàn)象的原因。

3 討論與結(jié)論

超低溫保存后植株的遺傳穩(wěn)定性是利用該技術(shù)保存植物種質(zhì)資源的關(guān)鍵問題。有關(guān)超低溫保存對(duì)植物遺傳穩(wěn)定性的影響已經(jīng)有比較多的研究[32]，總體來說這些研究表明超低溫保存后的植物材料是可以保持其遺傳穩(wěn)定性的。在本試驗(yàn)切花菊花粉的超低溫保存中，出現(xiàn)了超低溫保存后花粉活力明顯高于新鮮花粉及超低溫保存后花粉的授粉結(jié)實(shí)率也高于新鮮花粉的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在其他花卉的花粉超低溫保存后也存在，如梅花[14，22]、白掌[16]、芍藥[17]、牡丹[19]、榆葉梅和海棠[21]。這一現(xiàn)象反映出花粉在超低溫保存過程中出現(xiàn)了生理上的變化，有可能是超低溫冷凍及解凍的過程使花粉壁變得脆弱而有利于花粉的萌發(fā)，但其機(jī)制還須進(jìn)一步研究。理論上來看，利用花粉超低溫保存后活力提升的現(xiàn)象不僅可以實(shí)現(xiàn)花粉的長(zhǎng)期保存，更可以利用超低溫保存技術(shù)促進(jìn)花粉萌發(fā)率與授粉結(jié)實(shí)率的提升，實(shí)現(xiàn)花粉品質(zhì)的改良[16]。但由于超低溫保存技術(shù)應(yīng)用的歷史并不長(zhǎng)[33]，花粉超低溫保存的最長(zhǎng)年限和可用年限以及長(zhǎng)期保存后的雜交結(jié)實(shí)能力、雜交后代再生能力等長(zhǎng)期效果尚待進(jìn)一步研究。

切花菊為了觀賞性的需要，在長(zhǎng)期的選育過程中頭狀花序高度瓣化，導(dǎo)致花序中間產(chǎn)生花粉的管狀花很少，所以為了多收集花粉，在試驗(yàn)第1年共種植4批(分別于4、6、8、10月開花)切花菊以收集花粉及雜交育種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然在溫室環(huán)境中人工調(diào)控環(huán)境使其與秋菊自然開花的溫度、光照和光周期盡量相同，但在4、6、8月開花的切花菊的雄蕊幾乎都敗育，雌蕊也發(fā)育不正常，難以收集到花粉進(jìn)行授粉試驗(yàn)，只有在10月符合秋菊自然開花時(shí)間開放的切花菊雌雄蕊發(fā)育正常，可收集其花粉并進(jìn)行授粉作業(yè)。另外，由于從國(guó)外直接引進(jìn)的品種花粉量都較少，在后來的收集花粉和雜交育種中，采用了花粉量相對(duì)較多的作為育種中間材料的自育品種。

植物種質(zhì)資源是植物育種工作的物質(zhì)基礎(chǔ)。作物遺傳背景的多樣化對(duì)農(nóng)業(yè)的安全和可持續(xù)發(fā)展具有重要價(jià)值。植物超低溫研究的最終目標(biāo)就是通過超低溫保存技術(shù)常規(guī)化的儲(chǔ)存和利用植物種質(zhì)資源，特別是農(nóng)作物及其近緣種。超低溫保存種質(zhì)資源具有省時(shí)、省地、省空間和無病蟲害侵染等優(yōu)點(diǎn)，且設(shè)備簡(jiǎn)單、維護(hù)費(fèi)用低、只須定期補(bǔ)充液氮，安全、經(jīng)濟(jì)，節(jié)省空間和人力。迄今，已經(jīng)有多種農(nóng)作物的超低溫種植資源庫(kù)建立和運(yùn)行起來，瀕危野生植物的超低溫種質(zhì)資源庫(kù)也開始出現(xiàn)。花粉超低溫保存技術(shù)還因其操作簡(jiǎn)便、即時(shí)使用的特點(diǎn)使得其在農(nóng)作物育種中具有巨大的應(yīng)用潛力。我國(guó)目前已建立了一些重要農(nóng)作物的花粉超低溫保存庫(kù)，但在花卉育種中建立花粉超低溫保存庫(kù)的非常少，對(duì)于此項(xiàng)工作應(yīng)加強(qiáng)重視和相關(guān)技術(shù)的研究。