李大命， 張彤晴， 唐晟凱， 關(guān)浩勇， 劉燕山， 穆 歡， 黃越峰， 潘建林

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所/江蘇省內(nèi)陸水域漁業(yè)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210017； 2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046； 3.江蘇省洪澤湖漁業(yè)管理委員會(huì)辦公室，江蘇淮安 223300)

刀鱭(Coilianasus)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的洄游性中小型魚類，隸屬于鯡形鳀科(Engraulidae)鱭屬(Coilia)。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、環(huán)境污染及水利工程建設(shè)等因素，刀鱭天然資源趨于枯竭，保護(hù)刀鱭資源刻不容緩[1-4]。湖鱭是刀鱭的一種，為湖泊定居型，沒(méi)有洄游習(xí)性，它已成為我國(guó)淡水湖泊漁業(yè)資源的重要組成部分。研究表明，湖鱭和刀鱭在遺傳上沒(méi)有顯著差異，屬于同一種類[5-6]。遺傳多樣性是生物多樣性的一個(gè)重要方面，決定了物種的進(jìn)化潛能和對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力。掌握物種的遺傳多樣性水平是物種保護(hù)須要了解的重要內(nèi)容，可以為制定針對(duì)性的保護(hù)和管理策略提供科學(xué)依據(jù)。

魚類線粒體DNA是一種閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、不發(fā)生重組及進(jìn)化速度快等特征，使其成為分子群體遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)研究的重要分子標(biāo)記[7]。細(xì)胞色素b(cytochrome b，簡(jiǎn)稱Cytb)基因的結(jié)構(gòu)和功能在mtDNA的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中是被了解得最為清楚的，且其進(jìn)化速度適中[8-9]。線粒體DNA控制區(qū)(D-loop)為非編碼區(qū)，因缺乏編碼的選擇壓力而比其他線粒體基因的進(jìn)化速率更快，富含系統(tǒng)發(fā)育信息[10]。因此，Cytb基因和 D-loop區(qū)序已成為魚類種群遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性研究中常用的2個(gè)分子標(biāo)記。

洪澤湖面積為1 597 km2，是江蘇省第二大淡水湖泊，也是我國(guó)第四大淡水湖泊，具有漁業(yè)生產(chǎn)、工農(nóng)業(yè)及生活用水、航運(yùn)、旅游、泄洪行洪等多種功能[11]。洪澤湖漁業(yè)資源豐富，對(duì)湖區(qū)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)的發(fā)展有重要作用[12]。最近調(diào)查發(fā)現(xiàn)，洪澤湖有63種魚類，刀鱭在洪澤湖漁業(yè)產(chǎn)量的占比超過(guò)50%[13]。受江湖阻隔、過(guò)度捕撈和生境破壞等多種因素的影響，洪澤湖漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重威脅[13]。到目前為止，尚無(wú)有關(guān)洪澤湖湖鱭遺傳多樣性水平的研究報(bào)道。本研究采用Cytb基因和D-loop區(qū)序列作為分子標(biāo)記，對(duì)洪澤湖湖鱭遺傳多樣性開(kāi)展研究，這不僅有利于豐富洪澤湖魚類的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，而且可以為湖鱭種質(zhì)資源保護(hù)及合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集和處理

于2016年12月在洪澤湖用刺網(wǎng)捕獲湖鱭，隨機(jī)取40尾湖鱭樣本。用無(wú)水乙醇固定，帶回實(shí)驗(yàn)室并且置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取湖鱭肌肉組織用于基因組DNA的提取。采用Takara公司的DNA提取試劑盒提取總DNA，將DNA溶于滅菌超純水，保存于-20 ℃冰箱中備用。

擴(kuò)增Cytb基因序列的上游引物為L(zhǎng)14724(5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′)，下游引物為H15634(5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)[14]；擴(kuò)增D-loop區(qū)序列的上游引物為DF1(5′-CTAACTCCCAAAGCTAGAATTCT-3′)，下游引物為DR2(5′-ATCTTAGCA- TCTTCAGTG-3′)[2]。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR體系均為50 μL，包括2×Taq酶混合液(1.25 UTaq酶，0.2 mmol/L dNTP，1.5 mmol/L Mg2+)25 μL，各1 μL(10 μmol/L)上、下游引物，1 μL DNA模板，22 μL滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，53 ℃ 退火(Cytb)或55 ℃退火(D-loop)50 s，72 ℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下保存。

PCR產(chǎn)物純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX1.83軟件[15]對(duì)獲得的Cytb基因和D-loop區(qū)序列進(jìn)行多重比較，并人工校對(duì)。采用Mega 5.1軟件[16]分析序列堿基組成和變異位點(diǎn)，利用Kimura雙參數(shù)(Kimura-2-parameter)模型計(jì)算單倍型之間的遺傳距離，采用鄰接法(neighbour-joining method，簡(jiǎn)稱NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。利用DnaSP 5.0軟件[17]獲得群體序列遺傳多樣性參數(shù)，包括單倍型數(shù)(N)、單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異數(shù)(K)。采用Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)，同時(shí)結(jié)合核苷酸不配對(duì)分布分析檢驗(yàn)湖鱭種群歷史動(dòng)態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cytb基因和D-loop區(qū)序列堿基組成

本研究獲得40條1 141 bp的Cytb基因序列，共檢出14個(gè)變異位點(diǎn)，其中有9個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)、5個(gè)單一信息位點(diǎn)，沒(méi)有插入和缺失位點(diǎn)。4種堿基的平均含量分別為A(27.8%)、T(30.6%)、G(14.5%)、C(27.1%)，A+T的含量(58.4%)明顯高于G+C的含量(41.6%)(表1)。在第2、第3位點(diǎn)，堿基G的含量最低，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏向性。

表1 Cytb基因序列堿基組成

本研究獲得40條D-loop區(qū)序列，其長(zhǎng)度為1 214～1 290 bp，其中26條長(zhǎng)度為1 252 bp，占比65.0%；12條長(zhǎng)度為1 290 bp，占比30.0%；1條長(zhǎng)度為1 328 bp，占比2.5%；1條長(zhǎng)度為1 214 bp，占比2.5%。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，D-loop區(qū)序列有4處長(zhǎng)度為38 bp的插入或缺失序列。4種堿基的平均含量分別為A(33.3%)、T(33.5%)、G(14.2%)、C(19.0%)，A+T含量(66.8%)明顯高于G+C含量(33.2%)，表現(xiàn)出明顯的堿基組成偏倚性。D-loop區(qū)序列共檢出54個(gè)變異位點(diǎn)，其中27個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，27個(gè)單一信息位點(diǎn)。

2.2 種群遺傳多樣性參數(shù)

40條Cytb基因序列共定義13個(gè)單倍型(Hb1～Hb13)，單倍型Hb6的數(shù)量最多(19個(gè))，占比47.5%；單倍型Hb4和Hb8各有4個(gè)，均占比10.0%；單倍型Hb1、Hb3、Hb10各有2個(gè)，均占比5.0%；單倍型Hb2、Hb5、Hb7、Hb9、Hb11、Hb12、Hb13的數(shù)量均為1個(gè)，占比2.5%。單倍型多樣性為0.762±0.067，核苷酸多樣性為0.002 70±0.000 28，平均核苷酸差異數(shù)為 2.073。40條D-loop區(qū)序列共定義17個(gè)單倍型(Hd1～Hd17)，單倍型Hd11數(shù)量最多(21個(gè))，占比52.5%；單倍型Hd3、Hd8、Hd16的數(shù)量均為2個(gè)，均占比5.0%；單倍型Hd2、Hd4～Hd7、Hd9～Hd15、Hd17的數(shù)量均為1個(gè)，均占比2.5%；單倍型多樣性為0.727±0.078，核苷酸多樣性為 0.006 10±0.001 00，平均核苷酸差異數(shù)為7.378。整體來(lái)看，洪澤湖湖鱭種群遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。

2.3 單倍型系統(tǒng)樹(shù)

基于Kimura雙參數(shù)模型估算湖鱭單倍型之間的遺傳距離，結(jié)果表明，Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.004 之間，D-loop區(qū)序列單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.018之間。

以鳳鱭(Coiliamystus，GenBank登錄號(hào)為KF056322.1)為外群，采用NJ法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，Cytb基因D-loop區(qū)序列單倍型聚為一支(圖1、圖2)。

表2 洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性參數(shù)

2.4 種群歷史動(dòng)態(tài)

基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列的中性檢驗(yàn)結(jié)果(表3)表明，Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)產(chǎn)生的D和Fs均為負(fù)值，其中僅Cytb基因中性檢驗(yàn)產(chǎn)生的Fs值統(tǒng)計(jì)有極顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明Cytb基因序列進(jìn)化顯著偏離中性進(jìn)化。Cytb基因序列核苷酸不配對(duì)分布呈單峰類型(圖3)，而 D-loop 區(qū)序列核苷酸不配對(duì)分布成多峰型(圖4)。因此綜合來(lái)看，洪澤湖湖鱭可能經(jīng)歷了近期種群擴(kuò)張事件。

3 結(jié)論與討論

遺傳多樣性即基因多樣性，是指種內(nèi)不同群體間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異的總和。它不僅是生物多樣性的重要組成部分，也是物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的基礎(chǔ)，更是生命進(jìn)化和物種進(jìn)化的基礎(chǔ)。一個(gè)物種的遺傳多樣性與其適應(yīng)能力、生存能力、進(jìn)化潛力等密切相關(guān)[18-19]。物種的遺傳變異越豐富，對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)，反之，更容易受到環(huán)境變化的影響[9]。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量物種遺傳多樣性的2個(gè)常用參數(shù)。本研究采用線粒體Cytb基因和D-loop區(qū)序列作為分子標(biāo)記，分析洪澤湖湖鱭的遺傳多樣性。結(jié)果表明，基于Cytb基因的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.762±0.067、0.001 82±0.000 28，平均堿基差異數(shù)為2.073；基于D-loop區(qū)的湖鱭單倍型遺傳多樣性和核苷酸多樣性分別為0.727±0.078、0.006 10±0.001 00，平均堿基差異數(shù)為7.378，顯示出較高的遺傳多樣性。與基于Cytb基因序列相比，基于D-loop區(qū)序列湖鱭種群的遺傳多樣性相對(duì)較高，這是因?yàn)轸~類線粒體D-loop區(qū)序列受到的選擇壓力較小、進(jìn)化速率快，而Cytb基因作為線粒體編碼基因，其進(jìn)化速度相對(duì)較慢[7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，基于Cytb基因的洞庭湖(h：0.643 3，π：0.002 6)、鄱陽(yáng)湖(h：0.950 0，π：0.003 4)、太湖(h：0.857 0，π：0.002 1)和巢湖(h：0.901 5，π：0.002)湖鱭的遺傳多樣性水平[20]。可以得出，洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性水平高于洞庭湖湖鱭種群，低于鄱陽(yáng)湖、太湖、巢湖湖鱭種群。因此，洪澤湖湖鱭種群的遺傳多樣性水平有待進(jìn)一步提高。與湖鱭相比，基于Ctyb基因的刀鱭遺傳多樣性高于湖鱭[8]。同樣，基于D-loop區(qū)序列的刀鱭遺傳多樣性也高于湖鱭[2-4]。這是因?yàn)楹q是刀鱭的陸封型群體，由于奠基者效應(yīng)等因素的影響，其遺傳多樣性水平應(yīng)低于刀鱭[8]。

表3 湖鱭種群的中性檢測(cè)結(jié)果

整體來(lái)看，基于Cytb基因和D-loop區(qū)序列的洪澤湖湖鱭遺傳多樣性呈現(xiàn)出高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的特征。有研究者根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性標(biāo)準(zhǔn)，將魚類進(jìn)化情景分為4種類型(低h和低π、高h(yuǎn)和低π、低h和高π、低h和低π)[21]。可以看出，洪澤湖湖鱭遺傳多樣性屬于第2種類型。湖鱭種群的遺傳多樣性現(xiàn)狀被認(rèn)為可能是小的有效種群經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的穩(wěn)定后發(fā)生了擴(kuò)張，種群快速增長(zhǎng)有利于提高對(duì)新突變的保持力從而導(dǎo)致核苷酸多樣性降低。已有文獻(xiàn)報(bào)道，湖鱭多個(gè)地理種群的遺傳多樣性水平均具備這一特征[20]。從種群歷史動(dòng)態(tài)來(lái)看，Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗(yàn)產(chǎn)生的D和Fs均為負(fù)值，且Cytb基因的Fs值統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有顯著性差異，表明DNA進(jìn)化偏離了中性選擇[22-23]。同時(shí)，Cytb基因序列岐點(diǎn)分布圖呈現(xiàn)為單峰型，表明洪澤湖湖鱭近期經(jīng)歷了種群擴(kuò)張[24]。

基于Kimura雙參數(shù)模型Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.004之間，D-loop區(qū)單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.018之間。整體來(lái)看，單倍型之間的遺傳距離較小，說(shuō)明洪澤湖湖鱭個(gè)體之間的基因交流不受限制。這是因?yàn)楹q運(yùn)動(dòng)能力較強(qiáng)，個(gè)體間基因交流不存在地理隔離限制。從單倍型組成來(lái)看，13個(gè)Cytb基因單倍型中有19個(gè)優(yōu)勢(shì)單倍型Hb6，占比47.5%，17個(gè)D-loop區(qū)單倍型中有21個(gè)優(yōu)勢(shì)單倍型Hd11，占比52.5%，大多數(shù)僅有1個(gè)單倍型。由此可以看出，洪澤湖湖鱭單倍型組成具有不均勻性。一方面優(yōu)勢(shì)單倍型的個(gè)體適應(yīng)能力強(qiáng)，擁有更大的繁殖群體，而低頻率的單倍型則因環(huán)境適應(yīng)能力差，擁有的繁殖群體較小，更容易對(duì)整個(gè)種群的遺傳多樣性造成不利影響。因此，須要持續(xù)加強(qiáng)對(duì)湖鱭種質(zhì)資源的保護(hù)力度，通過(guò)控制捕撈強(qiáng)度、改善水體生態(tài)環(huán)境以及加強(qiáng)資源動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)等措施增加湖鱭資源量，提高其遺傳多樣性水平，改善種群遺傳結(jié)構(gòu)，從而有利于湖鱭資源的可持續(xù)發(fā)展。