徐 可 ，姜建國(guó) ，朱 娜 ，郝 偉 ，靳茂禮 ，曹鳳習(xí)

（1.河北省石家莊市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 石家莊 050031； 2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050011）

鹽酸二甲雙胍片屬生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（BCS）Ⅲ類藥物，具有高溶解性和低滲透性。臨床反饋，不同廠家產(chǎn)品臨床療效差異較大［1］。2015 年版《中國(guó)藥典（二部）》［2］收載的該藥現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以反映企業(yè)間工藝控制上的差異。本研究中選擇市售不同廠家生產(chǎn)的鹽酸二甲雙胍片仿制制劑與參比制劑，并對(duì)其在多種pH溶出介質(zhì)中溶出曲線的相似性進(jìn)行了評(píng)價(jià)［3-9］，為其仿制制劑的生產(chǎn)工藝和內(nèi)在質(zhì)量提升提供參考［10］，并對(duì)溶出度檢查方法及限度的修訂提出了建議?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、材料與試藥

儀器：EDT-14Lx型智能溶出試驗(yàn)儀（上海儀真分析儀器有限公司）；LC-20AD型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、Labsolution工作站（日本島津公司）；XS105型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；ZKT-18F型真空脫氣機(jī)（天津天大天發(fā)科技有限公司）。

試藥：鹽酸二甲雙胍對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100664-201604，純度為100%，105℃干燥2 h）；鹽酸二甲雙胍片均為國(guó)內(nèi)市售仿制制劑（規(guī)格均為每片0.25 g，生產(chǎn)企業(yè)及批號(hào)見(jiàn)表1）；甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó) Merck公司）；氯化鈉、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、無(wú)水磷酸氫二鈉（分析純，北京化工廠）；冰醋酸、鹽酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水為去離子純凈水。依據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《仿制藥參比制劑目錄（第五批）》（2017年第89號(hào)），采用鹽酸二甲雙胍片原研制劑（日本新藥株式會(huì)社，規(guī)格為每片 250 mg，批號(hào)為 357401，356501，355801）為參比制劑。

表1 鹽酸二甲雙胍片仿制制劑生產(chǎn)企業(yè)、規(guī)格及批號(hào)

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（取己烷磺酸鈉1.88 g，磷酸二氫鈉 0.78 g，加水溶解并稀釋至 1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié) pH 至 3.5±0.05）-乙腈（90∶10,V／V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：233 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

溶出介質(zhì)：參照第 17版《日本藥局方》［11］，4種溶出介質(zhì)的配制方法及37℃時(shí)鹽酸二甲雙胍在各溶出介質(zhì)中的溶解度見(jiàn)表2。各溶出介質(zhì)用水均為真空脫氣機(jī)經(jīng)42℃脫氣40 min處理后立即使用。

對(duì)照品溶液：稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品適量，精密稱定。以pH＝4.0醋酸鹽緩沖液、pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液和水為溶出介質(zhì)溶解并稀釋，制成每1 mL中約含鹽酸二甲雙胍56 μg的溶液；以pH＝1.2的鹽溶液為溶出介質(zhì)時(shí)，由于溶劑效應(yīng)，檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)相對(duì)較低，稀釋成每1 mL中約含鹽酸二甲雙胍278 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取樣品適量，按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則 0931 第二法（槳法），轉(zhuǎn)速 50 r／min，溶出介質(zhì)溫度為（37.0 ±0.5）℃ ，分別采用 4 種溶出介質(zhì)900 mL，依法操作，經(jīng)30 min取溶液適量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

空白輔料溶液：稱取生產(chǎn)企業(yè)處方中包含的所有輔料適量，精密稱定，按供試品溶液制備方法制成空白輔料溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取2.2項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照品溶液與空白輔料溶液各20 μL（以水為溶出介質(zhì)），注入液相色譜儀，記錄色譜圖。分別采用4種溶出介質(zhì)制備的此3種溶液進(jìn)樣，結(jié)果相應(yīng)色譜圖基本一致，以水為溶出介質(zhì)的色譜圖見(jiàn)圖1。二甲雙胍峰保留時(shí)間約為5.2 min，理論板數(shù)按二甲雙胍峰計(jì)應(yīng)不小于3 000，拖尾因子不超過(guò)1.5。主成分峰與溶劑、輔料及其他雜質(zhì)峰分離較好。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：以pH＝4.0的醋酸鹽緩沖液、pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液和水為溶出介質(zhì)時(shí)，精密稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品適量，精密稱定，分別用溶出介質(zhì)溶解并稀釋成每1 mL中約含鹽酸二甲雙胍10，20，30，50，70，100 μg 的溶液。各精密量取 20 μL，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，以鹽酸二甲雙胍質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得 回歸方程 分別為 Y ＝79 793.1X+28 251.0，r＝0.999 9（n＝6），Y＝79 836.7X+28 092.4，r＝0.999 9（n ＝6）和 Y ＝79 881.4X+28 479.5，r＝0.999 9（n ＝6）。結(jié)果顯示，鹽酸二甲雙胍質(zhì)量濃度在10～100 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。以pH＝1.2的鹽溶液為溶出介質(zhì)時(shí)，稱取鹽酸二甲雙胍對(duì)照品適量，精密稱定，同法稀釋成每1 mL中約含鹽酸二甲雙胍10，100，150，250，300，400 μg 的溶液，同法操作，得線性回歸方程為 Y ＝79 832.5X-27 922.0，r＝0.999 8（n＝6）。結(jié)果顯示，鹽酸二甲雙胍質(zhì)量濃度在10～400 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取4種溶出介質(zhì)制備的對(duì)照品溶液，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果 pH＝1.2的鹽溶液、pH＝4.0的醋酸鹽緩沖液、pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液和水為介質(zhì)時(shí)的 RSD分別為0.30%，0.34%，0.30% ，0.23% （n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液（J廠家，批號(hào)為3316179）適量，在室溫條件下放置 0，2，4，6，8，12，16，20，24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果以pH＝1.2的鹽溶液、pH＝4.0的醋酸鹽緩沖液、pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液和水為介質(zhì)時(shí)的 RSD分別為0.41% ，0.34% ，0.24%，0.30% （n ＝9），表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖1 高效液相色譜圖（溶出介質(zhì)為水）

回收率試驗(yàn)：按最大處方量取空白輔料，精密加入相當(dāng)于樣品含量80%，100%，120%的對(duì)照品各適量，每個(gè)水平各3份，分別使用4種溶出介質(zhì)，依法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果以pH＝1.2的鹽溶液、pH＝4.0的醋酸鹽緩沖液、pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液和水為介質(zhì)時(shí)的平均回收率分別為 99.01%，99.12%，99.27%，99.05% （n ＝9）。

2.5 溶出曲線測(cè)試方法

采用日本《醫(yī)療用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》（“橙皮書(shū)”）［12］中規(guī)定的鹽酸二甲雙胍片溶出曲線測(cè)試方法：槳法，轉(zhuǎn)速 50 r／min，溶出介質(zhì) 900 mL?？疾鞓悠吩?2.2項(xiàng)下4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線。取樣品12片，依法操作，經(jīng) 5，10，15，20，30，45 min 時(shí)，取溶液 5 mL，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL容量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻；以pH＝1.2的鹽溶液為溶出介質(zhì)時(shí)，取溶液5 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每片樣品在各時(shí)點(diǎn)的累積溶出度（%），以其平均值為縱坐標(biāo)、時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)繪制溶出曲線。

2.6 溶出曲線相似性比較原則

圖2 5家企業(yè)仿制藥與原研藥溶出曲線比較

依據(jù)《普通口服固體制劑溶出曲線測(cè)定與比較指導(dǎo)原則》，采用非模型依賴法中的相似因子（f2）法，比較仿制制劑與原研制劑溶出曲線的相似性及同一生產(chǎn)企業(yè)仿制制劑的批間差異。計(jì)算公式如下。其中，Rt為 t時(shí)間參比樣品平均溶出量，Tt為 t時(shí)間受試樣品平均溶出量，n為取樣時(shí)間點(diǎn)的個(gè)數(shù)。

相似性判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)2條溶出曲線 f2數(shù)值不小于50，或受試樣品和參比樣品在15 min的平均溶出量均不低于85%時(shí)，可認(rèn)為溶出曲線相似。

f2從統(tǒng)計(jì)學(xué)上度量了2條溶出曲線之間的相似性，f2值越大，說(shuō)明2條溶出曲線差異越小，若50≤f2≤100，可以推斷2條溶出曲線相似（完全相同的2條溶出曲線的 f2＝100）。

2.7 溶出曲線測(cè)定結(jié)果與相似性比較

原研制劑溶出曲線與批間差異：在4種溶出介質(zhì)中，3批次原研制劑在15 min的平均累積溶出度均高于85%，溶出曲線相似。日本“橙皮書(shū)”中收載了A、B兩種劑型的溶出曲線，試驗(yàn)結(jié)果證明該原研制劑為B型，屬快速釋放型。原研制劑批間基本無(wú)差異，產(chǎn)品質(zhì)量控制較好。

仿制制劑與原研制劑溶出曲線相似性比較：將12家生產(chǎn)企業(yè)的仿制制劑分別與原研制劑比較，詳見(jiàn)圖2至圖4。結(jié)果，僅G，J和H企業(yè)的仿制制劑在4種介質(zhì)中15 min的平均累積溶出度均超過(guò)85%，與原研制劑溶出曲線相似，占受試仿制藥生產(chǎn)企業(yè)總數(shù)的25.0%。其余75.0%的企業(yè)產(chǎn)品溶出曲線與原研制劑不相似，說(shuō)明其產(chǎn)品與原研制劑存在質(zhì)量差異，有待進(jìn)一步完善生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量。另有個(gè)別企業(yè)，如B企業(yè)生產(chǎn)的仿制制劑與原研制劑差異較大，在pH＝1.2的鹽溶液中，45 min內(nèi)平均累積溶出度不足10%，在pH＝4.0的醋酸鹽緩沖液中仍不足40%。溶出量較低將嚴(yán)重影響藥效的發(fā)揮。該廠家有待進(jìn)一步完善處方工藝，促進(jìn)藥物有效成分更好地釋放。

圖3 5家企業(yè)仿制藥與原研藥溶出曲線比較

圖4 5家企業(yè)仿制藥與原研藥溶出曲線比較

同一企業(yè)不同批次仿制制劑批間差異評(píng)價(jià)：樣中含2批次仿制制劑的生產(chǎn)企業(yè)有3家，分別為A，B，F(xiàn)企業(yè)，含3批次及以上仿制制劑的生產(chǎn)企業(yè)有5家，分別為 E，I，J，K，L 企業(yè)，前 3 家企業(yè)選所有批次，后 5 家企業(yè)隨機(jī)選取3批，測(cè)定樣品在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線。以每個(gè)企業(yè)任一批次產(chǎn)品的溶出曲線做參比，其他受試批次與之進(jìn)行比較。選擇合適的時(shí)間點(diǎn)，計(jì)算 f2。結(jié)果見(jiàn)表3。依據(jù)指導(dǎo)原則，J企業(yè)3批次產(chǎn)品在4種介質(zhì)中15 min的平均累積溶出度均達(dá)到85%以上，產(chǎn)品溶出曲線相似，批間差異較小。且與原研制劑的溶出曲線相似，該企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)于其他生產(chǎn)企業(yè)。A，B，E，F(xiàn)，K企業(yè)的不同批次產(chǎn)品在各溶出介質(zhì)中溶出曲線的 f2值均大于50，說(shuō)明上述各企業(yè)產(chǎn)品批間差異都很小，不同批次產(chǎn)品質(zhì)量基本一致。I，L企業(yè)的不同批次產(chǎn)品在各溶出介質(zhì)中溶出曲線不相似，f2值小于50，批間差異較大。

表3 在4種溶出介質(zhì)中各企業(yè)不同批次產(chǎn)品溶出曲線相似性比較

2.8 溶出度檢查項(xiàng)方法與限度修訂建議

仿制制劑按照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)［2］檢驗(yàn)表1中的41批次樣品：籃法，轉(zhuǎn)速100 r／min，以1 000 mL水為溶出介質(zhì)，45 min取樣，按2.1項(xiàng)下方法檢測(cè)，限度為標(biāo)示量的70%，合格率為100.0%，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量區(qū)分度較小。

依據(jù)溶出曲線測(cè)定結(jié)果，分析鹽酸二甲雙胍片在水中的溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢?jiàn)，樣品45 min的平均累積溶出度均接近100%，差異很小。3家企業(yè)樣品30 min的平均累積溶出度低于85%。

圖5 12家企業(yè)仿制制劑在水中的溶出曲線

建議將溶出度測(cè)定修訂為：槳法，轉(zhuǎn)速50 r／min，以900 mL水為溶出介質(zhì)，30 min取樣，限度為標(biāo)示量的85%。按擬訂標(biāo)準(zhǔn)對(duì)上述41批次樣品進(jìn)行溶出度檢查，有9家的產(chǎn)品符合規(guī)定，占企業(yè)總數(shù)的75.00%；其中35批次產(chǎn)品符合規(guī)定，合格率為85.37%，擬訂標(biāo)準(zhǔn)提高了檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同產(chǎn)品質(zhì)量的區(qū)分度。建議對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，并設(shè)定更高要求的限度，促進(jìn)仿制制劑總體質(zhì)量的提升。

3 討論

針對(duì)研究中發(fā)現(xiàn)的與原研制劑不相似的情況，與相關(guān)企業(yè)的生產(chǎn)、質(zhì)量部門(mén)人員就產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝、處方篩選、質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn)等問(wèn)題進(jìn)行溝通。從企業(yè)反映的情況與相關(guān)文獻(xiàn)資料［12-15］了解到，影響鹽酸二甲雙胍片溶出度的因素主要有2個(gè)：一是制片工藝中原料的粒徑。劑量較小的藥物與較多量的親水性輔料共同研磨粉碎，藥物與輔料的粒子逐步變小，最終形成在藥物粒子的周圍黏附著一層親水性輔料粒子的狀態(tài)，這樣既能將藥物粉碎得更細(xì)，又可使藥物粒子表面的親水性增強(qiáng)，改善藥物的溶出度。二是輔料的成分與配比。潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂等可增強(qiáng)片劑的疏水性，使水難以透入，致使片劑崩解遲緩。表面活性劑吐溫-80、十二烷基硫酸鈉等的加入，可降低介質(zhì)的表面張力，改善片劑的潤(rùn)濕性，加快片劑的崩解。崩解劑如淀粉、羧甲基淀粉鈉、低取代-羥丙纖維素、羧甲基纖維素鈣等都有較強(qiáng)的吸水膨脹性能，促進(jìn)片劑崩解。黏合劑如淀粉漿、羥丙基甲基纖維素的加入會(huì)影響制劑的溶出度。

溶出曲線能反映仿制制劑與參比制劑的質(zhì)量差異，大部分仿制制劑的內(nèi)在質(zhì)量有待進(jìn)一步提高，個(gè)別企業(yè)的產(chǎn)品差距較大，有待完善處方與工藝，以促進(jìn)藥物有效成分更好地釋放，有必要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)仿制制劑溶出曲線的考察，以確保藥品的質(zhì)量與療效。