張永昕 ，李莎恩 ，俞 發(fā) ，王振華 ，李 耿

（1.中國人民解放軍第四五八醫(yī)院，廣東 廣州 510602； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

補(bǔ)中益氣丸是由古代名方補(bǔ)中益氣湯改變劑型制成的丸劑，由補(bǔ)氣藥黃芪（炙）、黨參、甘草（炙）、白術(shù)（炒）、大棗，補(bǔ)血藥當(dāng)歸，理氣藥陳皮，發(fā)散風(fēng)熱藥升麻、柴胡，發(fā)散風(fēng)寒藥生姜10味藥組方［1］。其為現(xiàn)代常用升陽益氣、調(diào)補(bǔ)脾胃的代表方劑，在臨床多科多種疾病的治療中療效良好［2-7］。當(dāng)前的中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步強(qiáng)化了多藥味成分的檢測［8］，但現(xiàn)行《中國藥典》補(bǔ)中益氣丸“鑒別”項下，僅對組方中甘草、陳皮、當(dāng)歸3味藥進(jìn)行薄層定性鑒別，不能全面、系統(tǒng)地反映制劑內(nèi)在質(zhì)量。本試驗中在補(bǔ)中益氣丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，采用薄層色譜（TLC）法對組方中黃芪、柴胡、白術(shù)進(jìn)行了定性鑒別，操作簡單，重復(fù)性及穩(wěn)定性好，有益于提升制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Goodsee-Ⅱ型暗箱式薄層色譜攝影儀（上?？普苌萍加邢薰荆?；RE-6000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；GZX-9140MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TDL-5-A型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；103B型四兩裝高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；HH-SII-N14B型電熱恒溫水浴鍋（北京精科華瑞儀器有限公司）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DT1000型電子天平（江蘇省常熟市意歐儀器儀表有限公司）。

試藥：補(bǔ)中益氣丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號為1500047）；黃芪、甘草、陳皮、黨參、當(dāng)歸、升麻、白術(shù)、柴胡（均以收貨日期為批號，即20160711），打粉，干燥，密封保存，備用；黃芪甲苷（批號為 H-013-140729，純度為98%），柴胡皂苷 A（批號為C-024-140728，純度為98%），柴胡皂苷D（批號為C-026-140728，純度為98%），均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；柴胡對照藥材（批號為120992-201509），黃芪對照藥材（批號為 121462-201304），白術(shù)對照藥材（批號為120925-201109），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸、冰醋酸、硫酸、稀鹽酸、碳酸氫鈉、三氯化鋁、氫氧化鈉、甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、苯、石油醚（60～90℃）、乙醚、二氯甲烷、環(huán)己烷、對二甲氨基苯甲醛、香蘭素、純水、中性氧化鋁（100～120目）、D101大孔吸附樹脂等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪

2.1.1 溶液制備

取補(bǔ)中益氣丸（水丸）3 g，研細(xì)，加入甲醇20 mL，加熱回流提取1 h，濾過，濾液加于中性氧化鋁柱（100～120 目，5 g，內(nèi)徑 1.0 ～1.5 cm）上，以 40%甲醇 100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，藥液殘渣加入純化水30 mL，用玻璃棒攪拌溶解，加入新配的水飽和正丁醇萃取2次，每次20mL，合并，取正丁醇萃取液，用純化水潤洗2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇0.5 mL溶解，制成供試品溶液。取黃芪對照藥材約3 g，按供試品溶液制備方法制備黃芪對照藥材溶液。稱取適量黃芪甲苷對照品，精密稱定，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1 g／L的對照品溶液。參照補(bǔ)中益氣丸中除黃芪外，其他9味藥材組方比例和工藝配制陰性對照品，取3 g，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.1.2 薄層色譜鑒別

按2015年版《中國藥典（四部）》（通則0502）薄層色譜法試驗，分別吸取上述4種溶液各2μL，條帶狀點樣于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，晾干，105℃下加熱至斑點顯色清晰。日光下檢視，供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同棕褐色斑點，在與黃芪對照藥材溶液相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點，陰性無干擾。詳見圖1。

圖1 補(bǔ)中益氣丸中黃芪的薄層色譜圖

2.2 柴胡

2.2.1 溶液制備

取補(bǔ)中益氣丸（水丸）8 g，研細(xì)，加入新配的水飽和正丁醇80 mL，超聲處理45 min，濾過，以2%氫氧化鈉溶液潤洗濾液3次，每次50 mL，棄堿水液，取正丁醇液，再用正丁醇飽和的水潤洗2次，每次50 mL，棄水液，正丁醇液蒸干，殘渣加入甲醇1 mL使溶解，制成供試品溶液。取柴胡對照藥材約4 g，按供試品溶液制備方法制得對照藥材溶液。取適量柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品，精密稱定，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1 g／L的混合對照品溶液；參照補(bǔ)中益氣丸中，除柴胡外，其他9味藥材組方比例和工藝制備陰性對照品，取8 g，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.2.2 薄層色譜鑒別

展開劑選擇“試驗一”：取上述4種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）為展開劑，展開取出，晾干，再以乙酸乙酯-乙醇 - 水（18 ∶2 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，放置15 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液與對照藥材溶液色譜中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d斑點不能完全分離，方法有待優(yōu)化。詳見圖2。

圖2 補(bǔ)中益氣丸中柴胡的薄層色譜圖（1）

展開劑選擇“試驗二”：取上述4種溶液各5 μL，依次點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-乙醇-水（7∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，再以乙酸乙酯 -乙醇-水（14∶2∶1）的混合液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，放置15 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。點板環(huán)境要干燥，濕度不能太大。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。詳見圖3。故此方法可作為柴胡的定性鑒別方法。

圖3 補(bǔ)中益氣丸中柴胡的薄層色譜圖（2）

2.3 白術(shù)

2.3.1 溶液制備

樣品提取“試驗一”：取補(bǔ)中益氣丸（水丸）5 g，研細(xì)至干燥，置燒瓶中，加正己烷10 mL，超聲（180 W，40 kHz）處理15 min，趁熱濾過，將濾液低溫蒸干，殘渣加正己烷1 mL使其完全溶解，制得供試品溶液。取白術(shù)對照藥材約0.5 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。參照補(bǔ)中益氣丸中，除白術(shù)外，其他9味藥材組方配制缺白術(shù)的陰性對照品，取8 g，同法制得陰性對照品溶液。

樣品提取“試驗二”：取補(bǔ)中益氣丸（水丸）5 g，研細(xì)至干燥，置燒瓶中，加水300 mL，用玻璃棒攪拌使藥粉充分混合均勻，連接回流冷凝管和揮發(fā)油測定器。從冷凝管上端加水至刻度，用滴管滴入正己烷2 mL，連接回流冷凝管。緩慢加熱至沸騰，保持沸騰狀態(tài)2 h，停止加熱，靜置片刻，將水緩緩放出，收集正己烷液，制成供試品溶液［9］。取白術(shù)對照藥材約 0.5 g，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。參照補(bǔ)中益氣丸中，除白術(shù)外，其他9味藥材組方配制缺白術(shù)的陰性對照品，取8 g，同法制得陰性對照品溶液。

2.3.2 薄層色譜鑒別

分別取上述2種方法制備的供試品溶液、陰性對照品溶液、對照藥材溶液各10 μL，依次點于2種方法對應(yīng)的硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（50∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。“試驗一”中，供試品溶液色譜在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上無相同顏色的斑點（見圖4），表明供試品溶液的制備方法還有待優(yōu)化，此方法不可行?！霸囼灦敝校┰嚻啡芤荷V在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾（見圖5），表明此方法可作為白術(shù)的定性鑒別方法。

圖4 補(bǔ)中益氣丸中白術(shù)的薄層色譜圖（1）

3 討論

薄層色譜法目前廣泛應(yīng)用于中藥材和中成藥的定性鑒別［10］，但易受樣品的預(yù)處理、展開劑等相關(guān)因素影響［11-12］，故研究中需根據(jù)具體中藥制劑組方調(diào)整薄層鑒別方法，包括改進(jìn)藥典中的樣品提取方法和色譜展開條件，以得到斑點清晰、無雜質(zhì)干擾、重復(fù)性好的色譜圖［13］。本研究中參考了標(biāo)準(zhǔn)項下的薄層鑒別項，以及藥典中相關(guān)中藥成方制劑處方中相關(guān)藥材成分的薄層色譜鑒別方法，并借鑒了中藥成方制劑和中藥材的定性鑒別相關(guān)文獻(xiàn)，通過多次試驗論證，增補(bǔ)和完善了補(bǔ)中益氣丸（水丸）中相關(guān)藥味的薄層色譜定性鑒別方法。

在柴胡的薄層色譜定性鑒別研究中，展開劑的選擇非常關(guān)鍵，作為展開劑的溶劑應(yīng)符合適當(dāng)?shù)募兌群头€(wěn)定性、低黏度、線性分配等溫線等條件［14］。本試驗中通過多次預(yù)試驗，如采用藥典鑒別方法所提供的單次展開無法清楚分開柴胡皂苷a和柴胡皂苷d時，通過借鑒相關(guān)文獻(xiàn)資料提供的二次展開方法也未能實現(xiàn)完全分離。研究中通過改進(jìn)，以醋酸乙酯-乙醇-水（7∶2∶1）為展開劑，一次展開，再以醋酸乙酯-乙醇-水（14∶2∶1）進(jìn)行二次展開，最終選擇了適合比例的溶劑作為展開劑，取得了較滿意的結(jié)果。

在白術(shù)的薄層色譜定性鑒別研究中，對展開劑、展開方式和樣品提取方式進(jìn)行了優(yōu)化［15］。由于其指標(biāo)成分蒼術(shù)酮不穩(wěn)定，故本試驗中以白術(shù)對照藥材為對照物，在供試品溶液制備中借鑒了相關(guān)文獻(xiàn)中揮發(fā)油的提取方法［9］，最終得到了與藥典記錄一致的明顯斑點。建議在補(bǔ)中益氣丸的生產(chǎn)工藝中，對白術(shù)的炮制可先炮制后切段，從而可減少藥材中有效成分的流失。

本試驗中，在補(bǔ)中益氣丸現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了對其中藥味黃芪、柴胡、白術(shù)的薄層色譜鑒別，進(jìn)一步完善了補(bǔ)中益氣丸的相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。建立的薄層色譜鑒別方法，針對性強(qiáng)，斑點清晰，分離效果好，穩(wěn)定性及重復(fù)性良好，陰性無干擾，可用于補(bǔ)中益氣丸（水丸）中上述藥味的定性鑒別。不足之處在于，對黨參的薄層色譜鑒別探索中，參考了藥典中多種對于黨參的薄層色譜提取方法，并參閱了各文獻(xiàn)中的思路，采用了大孔樹脂、中性氧化鋁等柱層析方法，可能由于受到補(bǔ)中益氣丸中輔料的影響，均表現(xiàn)出色譜斑點不清晰或斑點無法區(qū)分，存在陰性干擾，無法取得滿意效果，仍需進(jìn)一步研究。