鄒奕 ，閆彩燕 ，邳植 ，2，3*

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

蛋白質(zhì)翻譯后修飾是指mRNA翻譯為蛋白質(zhì)后對(duì)蛋白質(zhì)上個(gè)別氨基酸殘基進(jìn)行共價(jià)修飾的過(guò)程，在生命體中具有十分重要的作用。這一過(guò)程使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，功能更完善，調(diào)控更精準(zhǔn)。在真核細(xì)胞中常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾約有20多種。其中，蛋白質(zhì)的可逆磷酸化修飾是最為常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。Fisher和Kerbs研究證實(shí)蛋白質(zhì)的可逆磷酸化在生物調(diào)控機(jī)制中的重要地位，該項(xiàng)研究最終獲得1992年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[1－2]。蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的Ser、Thr、Tyr殘基，調(diào)控酶活性、亞細(xì)胞定位，蛋白質(zhì)相互作用涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、發(fā)育和分化等生理過(guò)程[3－4]。值得注意的是在植物中編碼蛋白激酶的基因約占功能基因總數(shù)的4%，相當(dāng)于人類(lèi)基因組中所占比例的2倍[5]。這暗示著植物這種缺乏逃避逆境能力的生物具有復(fù)雜磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)感應(yīng)外界環(huán)境變化，從而精準(zhǔn)、快速地調(diào)節(jié)自身代謝途徑以適應(yīng)逆境。

蛋白質(zhì)的可逆磷酸化修飾由蛋白激酶和蛋白磷酸酶參與，在蛋白激酶的作用下ATP中的磷酸基團(tuán)被轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)氨基酸殘基的羥基[6]。相反，蛋白磷酸酶可將蛋白質(zhì)中的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至ADP，使蛋白質(zhì)發(fā)生去磷酸化作用。以往研究表明，植物基因組中約含有1400個(gè)編碼蛋白激酶的基因，而編碼磷酸酶的基因數(shù)目?jī)H有為蛋白激酶的1/10左右[7]。這就意味著單一蛋白磷酸酶可能負(fù)責(zé)多個(gè)蛋白激酶的可逆磷酸化過(guò)程，對(duì)于植物適應(yīng)外界環(huán)境具有重要意義。根據(jù)其底物特異性蛋白磷酸酶可分為絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶類(lèi)（protein serine/threonine phosphatases，PSP）和酪氨酸蛋白磷酸酶類(lèi)（protein tyrosine phosphatases，PTP）兩大類(lèi)[8]。

系統(tǒng)進(jìn)化分析可以將 PSP分為 PPP （plant protein phosphatase） 和 PPM （metal－dependent protein phosphatases）兩支[9]。 PPP 支主要包括 PP1、PP2A、PP2B（PP3）、PP4、PP5、PP6、PP7、Kelch、SLP 以及 PPP Unique共10個(gè)家族。PP1家族蛋白活性主要受熱穩(wěn)定蛋白l1和l2抑制，PP2A和PP2B（PP3）家族成員均不受蛋白l1和l2抑制，但PP2B（PP3）家族蛋白活性需要Ca2+激活，PP2A家族蛋白活性則不依賴(lài)2價(jià)金屬離子[10]。PP4家族成員含有兩個(gè)高保守的調(diào)控亞基R1和R2，PP5家族成員則在N－末端含有一個(gè)具有決定蛋白互作關(guān)系的TPR結(jié)構(gòu)域，PP6家族成員則含有高保守的SAPS調(diào)控亞基和錨蛋白重復(fù)亞基，PP7家族成員則催化亞基同時(shí)分布在C－和N－末端，且同時(shí)含有EF結(jié)構(gòu)域。Kelch家族成員主要包括BSU1、BSL1、BSL2，在N－末端含有重復(fù)Kelch結(jié)構(gòu)，主要參與BR信號(hào)通路[11]。PPM支主要包活PP2C和PDP兩大家族。PDP家族成員含有PP2C催化結(jié)構(gòu)域，主要與丙酮酸脫氫酶結(jié)合，催化該酶的去磷酸化過(guò)程[12]。PTP類(lèi)根據(jù)含有磷酸酶功能結(jié)構(gòu)域和催化功能不同可以分為 classical PTP、DSP、Asp Based PTP、CDC25、LMWPTP、PTPLA 幾支[13]。

甜菜為藜科二年生植物，是我國(guó)三北地區(qū)最主要的糖料作物，也是北方最具競(jìng)爭(zhēng)力和潛力的經(jīng)濟(jì)作物，具有栽培技術(shù)體系完善，機(jī)械化程度高，不與主糧爭(zhēng)地，土地利用率高，兼顧生態(tài)效益等多方面優(yōu)勢(shì)。然而，國(guó)內(nèi)利用生物信息學(xué)對(duì)于甜菜基因家族的研究相對(duì)較少。自甜菜基因組信息發(fā)布以來(lái)，尚無(wú)關(guān)于磷酸酶超家族分析的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究利用生物信息學(xué)的手段對(duì)甜菜磷酸酶超家族進(jìn)行分析。

1 試驗(yàn)方法

1.1 甜菜磷酸酶超家族的鑒定與篩選

首先，從甜菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bvseq.molgen.mpg.de）下載甜菜蛋白質(zhì)組信息[14]。利用EKPD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ekpd.biocuckoo.org）中29個(gè)蛋白磷酸酶HMM模型檢索甜菜蛋白質(zhì)組序列，E－value閾值設(shè)為＜1[15－16]。隨后，將檢索到的候選甜菜磷酸酶分別進(jìn)行Pfam、Interpro和SMART蛋白結(jié)構(gòu)域分析，剔除不含有磷酸酶功能結(jié)構(gòu)域的序列。最后，利用在線(xiàn)軟件Compute pI/Mw和TargetP對(duì)篩選到的蛋白磷酸酶分子量、等電點(diǎn)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)[17－18]。

1.2 甜菜磷酸酶超家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

根據(jù)hmmsearch結(jié)果提取甜菜磷酸酶蛋白中得分最高的磷酸酶結(jié)構(gòu)域序列。隨后，利用Cluster Omega對(duì)挑選出的磷酸酶結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行序列比對(duì)，所有參數(shù)采用默認(rèn)值[19]。對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行人工校正后，以甜菜果糖－1,6－二磷酸酶（Bv2_024290 rmpf.t1）果糖二磷酸結(jié)構(gòu)域序列作為外類(lèi)群，采用iqtree軟件構(gòu)建Maximum likelihood進(jìn)化樹(shù)[20]。根據(jù)ModelFinder計(jì)算結(jié)果選擇WAG+F+G4為最優(yōu)模型，bootstrap設(shè)置為1000[21]。建樹(shù)結(jié)果利用Evolview軟件進(jìn)行可視化及注釋[22]。

1.3 甜菜磷酸酶超家族聚類(lèi)分析

甜菜各磷酸酶家族基因數(shù)目根據(jù)hmmsearch和進(jìn)化樹(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，其他物種磷酸酶家族數(shù)目來(lái)源于EKPD數(shù)據(jù)庫(kù)。為了避免基因組大小對(duì)不同物種磷酸酶基因家族比較的干擾，計(jì)算各磷酸酶家族在基因組中所占比例，并以擬南芥作為對(duì)照。根據(jù)甜菜及各物種磷酸酶家族大小進(jìn)行層次聚類(lèi)分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 甜菜蛋白磷酸酶超家族的鑒定

利用HMMER軟件對(duì)甜菜基因組進(jìn)行分析，總共檢索到163個(gè)候選蛋白磷酸酶。進(jìn)一步通過(guò)Pfam、Interpro、SMART蛋白結(jié)構(gòu)域分析，最終從中篩選出143個(gè)編碼蛋白磷酸酶的基因，約占甜菜基因組編碼基因的0.5%。其數(shù)目略低于擬南芥（162個(gè)）、玉米（225個(gè)）、水稻（164個(gè)）等模式植物，但與其他物種所占基因組比例相近（0.35%～0.59%）。其中，編碼蛋白磷酸酶序列長(zhǎng)度范圍454 aa～1555 aa，分子量范圍5.8 kDa～169.1 kDa，等電點(diǎn)范圍3.9～10.3。利用TargetP對(duì)甜菜蛋白磷酸酶亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示分別約有19.3%、10.3%和5.5%的蛋白磷酸酶定位于葉綠體、線(xiàn)粒體和細(xì)胞核。

2.2 甜菜蛋白磷酸酶超家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

以143個(gè)甜菜蛋白磷酸酶結(jié)構(gòu)域序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，甜菜蛋白磷酸酶超家族可分為PSP和PTP兩個(gè)大支（圖1）。PSP一支涉及PP2C、PPP和CDC25家族。其中，PP2C家族含有63個(gè)基因，遠(yuǎn)多于PPP家族（16個(gè)）和其他磷酸酶家族基因數(shù)目；PP2C家族成員蛋白活性主要依賴(lài)于Mn2+和Mg2+，是植物中家族成員最多的一類(lèi)蛋白磷酸酶[11]。CDC25家族含有兩個(gè)基因，以往研究表明CDC25家族在植物中的成員相對(duì)較少，特異識(shí)別依賴(lài)性激酶（CDK），催化Thr14和Thr15的去磷酸化[23]。在甜菜中CDC25家族被分入PSP，其原因可能是甜菜CDC25結(jié)構(gòu)域不完整導(dǎo)致。PTP一支包括Asp based PTP、DSP、LMWPTP、PTPLA 和 NRPTP，5 個(gè)磷酸酶家族。其中，Asp based PTP和DSP磷酸酶家族基因數(shù)目較多，分別為31個(gè)和25個(gè)。Asp Based PTP家族成員參與催化反應(yīng)需要Asp作為親核基團(tuán)[11]。DSP家族成員不僅能夠催化酪氨酸殘基去磷酸化，還能催化絲氨酸和蘇氨酸去磷酸化，進(jìn)一步催化底物和結(jié)構(gòu)域不同的7個(gè)家族[24]。LMWPTP、PTPLA和NRPTP家族所含基因數(shù)目較少，總共僅包含6個(gè)基因。LMWPTP家族是近些年新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)蛋白磷酸酶家族，該家族成員具有較小的分子量，一般約為18 kDa[25]。PTPLA家族成員中酪氨酸磷酸酶保守基序CXXXXXR變異為CXXXXXA，對(duì)植物器官的發(fā)育、分化和維持具有重要作用[26]。

圖1 甜菜蛋白磷酸酶超家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of protein phosphatase superfamily in sugar beet

2.3 甜菜蛋白磷酸酶超家族聚類(lèi)分析

根據(jù)hmmsearch和進(jìn)化樹(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)各磷酸酶家族基因數(shù)目，通過(guò)層次聚類(lèi)分析（圖2）發(fā)現(xiàn)甜菜磷酸酶超家族基因分布狀況與衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、 小 立 碗 蘚（Physcomitrella patens）和紅藻（Cyanidioschyzon merolae）等孢子植物更近。這說(shuō)明甜菜磷酸酶超家族成員在甜菜進(jìn)化過(guò)程中較為保守。與其他物種相比，甜菜具有PPP家族較小的特點(diǎn)，PP1、PP2A、PP2B、PP4、PP5、PP6、PP7、Kelch 亞家族所含基因數(shù)目均只有擬南芥的一半。此外，CDC14、CDC25和 MDP1家族基因數(shù)目分別含為5個(gè)、2個(gè)、2個(gè)，而在其他物種中數(shù)目較少，甚至沒(méi)有。CDC14家族成員在N－末端具有一個(gè)高度保守的特異結(jié)構(gòu)域，能夠催化CDK激酶底物發(fā)生去磷酸化作用[11]。MDP1家族成員在催化中心存在數(shù)個(gè)氨基酸的變異，能夠結(jié)合更多種類(lèi)的底物[23]。

圖2 不同物種間蛋白磷酸酶超家族聚類(lèi)分析Fig.2 Cluster analysis of protein phosphatase superfamily among different species

3 討論

本研究利用生物信息學(xué)對(duì)甜菜蛋白磷酸酶超家族進(jìn)行初步分析，從甜菜基因組中共篩選出143個(gè)蛋白磷酸酶，構(gòu)建甜菜磷酸酶超家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。與擬南芥、玉米等植物相比，甜菜各蛋白磷酸酶家族基因數(shù)目基本呈現(xiàn)較少或持平的形勢(shì)。有趣的是甜菜磷酸酶家族成員分布與衣藻、紅藻和小立碗蘚等孢子植物相近，說(shuō)明甜菜物種起源較早且蛋白磷酸酶超家族在物種進(jìn)化中較為保守。

與其他高等植物相比，甜菜中CDC14、CDC25和MDP1家族數(shù)目具有一定優(yōu)勢(shì)，這些家族成員在進(jìn)化過(guò)程中未被淘汰，暗示其對(duì)甜菜生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成具有一定作用。大多數(shù)植物基因組中沒(méi)有或極少量含有編碼CDC14和CDC25的基因，而在甜菜中分別發(fā)現(xiàn)5個(gè)和2個(gè)編碼CDC14和CDC25的基因。CDC14家族是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵因子，在DNA復(fù)制、有絲分裂退出和胞質(zhì)分裂中起重要作用。在DNA修復(fù)期間可以促進(jìn)紡錘體穩(wěn)定，是中期紡錘體維持、修復(fù)過(guò)程的關(guān)鍵[27]。CDC25家族同樣是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠催化CDK中的Thr14和Tyr15發(fā)生去磷酸化，從而激活CDK活性，達(dá)到驅(qū)動(dòng)整個(gè)細(xì)胞周期的作用[23，28]。雖然，在甜菜中還未發(fā)現(xiàn)具有CDC25家族全長(zhǎng)的同源基因，但是存在與C末端磷酸酶結(jié)構(gòu)域直系同源的短序列成員。Spadafora等通過(guò)分析擬南芥CDC25突變體發(fā)現(xiàn)，缺失CDC25基因后擬南芥突變體對(duì)羥基脲引起的DNA損傷更為敏感，抑制擬南芥根部生長(zhǎng)[29]。相反，過(guò)表達(dá)CDC25基因有助于提高擬南芥對(duì)DNA損傷修復(fù)的能力。因此，甜菜基因組中含有較多的CDC14和CDC25家族磷酸酶可能與甜菜逆境損傷修復(fù)和根部細(xì)胞增殖相關(guān)。在甜菜基因組中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)編碼MDP1（Magnesium－dependent phosphatase 1）的基因，而在植物中相關(guān)功能報(bào)道較少。Yin等利用基因干擾手段對(duì)腫瘤細(xì)胞中MDP1功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MDP1參與細(xì)胞增殖過(guò)程，其表達(dá)受抑制后細(xì)胞G0/G1細(xì)胞周期阻滯，導(dǎo)致大量細(xì)胞停滯在G1期[30]。但是，MDP1是否參與甜菜細(xì)胞增殖仍未見(jiàn)報(bào)道，值得進(jìn)一步研究。